[发明专利]一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其方法，属化妆品、药品、保健品技术领域。

背景技术

鞣花酸 (ellagic acid)，分子式 C₁₄H₆O₈，它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。是一种广泛存在于各种坚果、水果中的天然多酚类化合物，尤以石榴皮中含量丰富。但游离态的较少，更多的是以缩合形式 ( 如鞣花单宁、苷等 ) 存在。鞣花酸纯品是一种黄色针状晶体，微溶于水、醇，溶于热甲醇、碱和吡啶。

近20年的研究发现鞣花酸具有较强的抗脂质过氧化、捕捉自由基的能力；可以抑制致癌剂的代谢活动，解除致癌物的毒性；对人体免疫缺陷病毒具有抑制作用；还具有胃肠动力学和泌尿生殖动力学作用，以及具有凝血、降压、镇静作用。因此，倍受人们关注。

鞣花酸可以通过提取、化学合成法和天然产物降解法得到，具体制备方法主要有以下几种：

第一种是从植物中提取鞣花酸。在橡椀、树莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量游离的鞣花酸 (1％)，用此法可制备高纯度的鞣花酸。但由于原料成本较高、且鞣花酸含量低，在生产上没有实际意义。

第二种是通过没食子酸(或其酯)的氧化聚合。合成前体物质——没食子酸(酯)需要在酶的作用下氧化聚合制取鞣花酸。此法鞣花酸的产率为 20％～30％。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且合成产物中存在未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为 1∶2.4，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此法进行鞣花酸的生产。

第三种是酸水解法制备鞣花酸的工艺(专利号：200510002081.X)，此法具有较高的产率和纯度，但需消耗高浓度强酸，并在长时间加热条件下完成，对设备抗腐蚀能力要求很高，对环境污染较重。

第四种是目前公开的以石榴皮为原料非化学制备鞣花酸的方法。其一是酶催化法(专利号：200810056007.X)，其主要过程分为两步：液态发酵产酶阶段和酶促转化阶段，此法过程繁琐，且酶促转化条件要求严格，不易控制。公开的另一方法是黑曲霉固态发酵法（专利号：201010178430.4），其过程是石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量 47％～60％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％ NaCl、0.1％ MgSO₄和0.5％NH₄NO₃，其中NH₄NO₃ 作为N源，pH 5～7，115℃灭菌30 min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3.316) 孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为 5 g石榴皮添加1mL浓度为1×10¹⁰个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30 ℃发酵 5～7天，得到含有鞣花酸的发酵产物。该方法使用发酵罐固态发酵，装料与出料均比较麻烦，上下部分发酵不均匀；再是该法仅使用单一菌种发酵，效率有待提高，这些对大规模工业化生产有一定的限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种以石榴皮为底物制备鞣花酸更高效的固态发酵方法。通过直接以石榴皮粉末为发酵底物，经黑曲霉与大肠杆菌固态发酵法生产鞣花酸，经甲醇萃取得到高纯度鞣花酸。该方法操作简单，鞣花酸的纯度和产率较高。

本发明以黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌（Escherichia. Coli）为发酵菌种，以石榴皮粉末为发酵底物，进行固态发酵。发酵过程中，黑曲霉和大肠杆菌均合成单宁酶并将其分泌到胞外，单宁酶催化石榴皮中的鞣花单宁降解生成鞣花酸，发酵产物经萃取和洗涤纯化获得高纯度鞣花酸，包括以下步骤：

一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸，其特征在于，包括以下步骤 ：

（1）发酵菌悬液制备

先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%～1%的(NH₄)₂HPO₃, 0.1%～0.2%的MgCl₂，0.1%-0.2%Na₂SO₄，每1 L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×10⁷个/mL以上，黑曲霉孢子数1×10⁸个/mL以上。

（2）石榴皮发酵床准备