[发明专利]重组EcoRV限制性内切酶的制备方法

权利要求书

1.重组EcoR V限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)表达质粒pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶的构建；

(2)EcoR V与甲基化酶蛋白的诱导表达与鉴定；

(3)EcoR V与甲基化酶蛋白的纯化与鉴定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括以下步骤：

(4)EcoR V与甲基化酶的基因合成

根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成；

(5)Gibson重组连接

将pCreat Duet通过酶切进行线性化，线性化产物与步骤(4)的基因合成产物进行无缝克隆；

(6)重组产物转化

将上述重组连接产物20μL转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，42℃热激90s，冰上再静置2min；加入600ul LB液体培养基，37℃摇床200rpm摇45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，37℃培养箱培养过夜；

(7)重组克隆的鉴定

随机挑取至少4个单克隆，接入4mL含卡那霉素LB中；37℃摇床220rpm摇过夜，抽提质粒并测序。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括以下步骤：

(8)重组质粒转化大肠杆菌

将上述鉴定为阳性的重组质粒pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜；

(9)IPTG诱导蛋白表达

挑单克隆于含卡那霉素LB中，37℃摇床，220rpm培养过夜，以1∶100接过夜菌于4mL含卡那霉素LB板中，继续培养2.5h，OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM，于15℃过夜诱导蛋白表达；

(10)SDS-PAGE鉴定

取2mL菌液12000rpm离心1min收集菌体，加入100μL的1×上样缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm离心1min，取10μL样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快染仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示目的蛋白有表达。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体包括以下步骤：

(11)EcoR V-甲基化酶蛋白的诱导表达

将过夜培养已转入pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶的BL21(DE3)菌液以1∶100接于800ml含卡那霉素LB中，37℃摇床，220rpm培养2h，OD600nm达到0.6-0.8时，加入IPTG至0.5mM，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；

(12)细菌蛋白表达形式的分析

-20℃冻存菌体按每克湿菌5mL的比例加入细菌裂解液，超声破菌，4℃，16000rpm离心15min，沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示EcoR V蛋白一部分存在于上清中；

(13)EcoR V蛋白的纯化

收集菌体加入裂解液重悬，超声破碎后离心，16000rpm离心15min，将上清液置于50ml的离心管中加入2ml Ni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml；利用含有20mM咪唑的裂解液洗脱30ml，含有500mM咪唑的裂解液洗脱5ml；以EcoR V储存液作为流动相过分子筛Superdex 200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的SDS-PAGE进行检测。