[发明专利]一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法

权利要求书

1.一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）顶芽进行表面消毒：用自来水将多花黄精顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡10～30s，然后用无菌水冲洗一次，再用5～18％的NaClO浸泡3～10min，随后用无菌水冲洗三次备用；

（2）用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，但不限于两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织或多份顶芽组织作为外植体备用；

（3）无菌条件下，将处理后的外植体，切面向下平铺于诱导培养基中，诱导培养基组分为1/2MS培养基，另外添加2～7mg/L的6-BA、0.1～0.4mg/L的NAA、0.2～0.8mg/L的TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8，培养温度为23±1℃，湿度为60％；初始2d进行暗培养，然后在光照强度1500～2400lx，光照12h、黑暗12h的光周期条件下培养，8～14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶，将带叶嫩茎在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm，将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面，培养20～34d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生；

（4）步骤（3）得到的愈伤组织继续培养40～60d，待其细胞分裂增殖至体积1cm³时，在无菌超净工作台内将其切下，并切成大小为0.5cm³的小块，将小块的愈伤组织再平铺于步骤（3）采用的诱导培养基中，并在温度为23±1℃，湿度为60％，光照强度1500～2400lx，光照12h、黑暗12h的光周期条件下培养30d后愈伤组织表面长出不定芽；

（5）步骤（4）得到的不定芽在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块状茎组织，将切下的小芽转移至生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，额外添加浓度0.2～0.8mg/L的NAA，浓度2～5g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8，温度24±1℃下暗培养2d后，再在温度为23±1℃，湿度为60％，光照强度1500～2400lx，光照12h、黑暗12h光周期条件下培养，培养15～24d后，不定芽开始陆续长根，待根长出2条以上，平均长度1～3cm时，即进行炼苗；

（6）炼苗移栽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的顶芽，是指于3月下旬至4月上旬，从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，在茎尖以下3cm处剪切，即得顶芽。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡15～20s；然后用无菌水冲洗一次，再用9～15％的NaClO浸泡4～8min；随后用无菌水冲洗三次备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中将步骤（4）得到的不定芽在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块状茎组织，将切下的小芽转移至生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，额外添加浓度0.2～0.5mg/L的NAA，浓度2～3.5g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述的炼苗移栽是指将步骤（5）得到的装有生根组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和20～30℃，培养3d，然后将组培容器瓶盖打开一半培养12～24h；取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中，该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照(8～12)：(4～6)：(2～6)：(1～3)的体积比混合后在100℃高温下常压灭菌15～26h，移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％、每天通风3～5次的条件下培养，待单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田或林下培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，泥炭土、蛭石、泥土、有机肥体积比为(8～10)：(4～5)：(3.5～5)：(1～2)。