[发明专利]一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，其特征在于：是将由克隆得到的dex-YG基因插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG作为模板，并经过473位和856位双位点的定点突变，筛选后得到耐热、酶活高的双突变体P473S/P856S，于宿主菌E.ColiBL21(DE3)中转化得到的重组工程菌dex-YG-thMU01。

2.根据权利要求1所述的表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，其特征在于：

所述基因工程菌dex-YG-thMU01的保藏编号为CGMCC No.12438。

3.一种权利要求1所述的表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌的构建方法，包括引物设计、构建重组表达质粒、基因工程定点突变和宿主菌转化各单元过程，其特征在于：

所述引物设计是根据克隆得到的dex-YG基因序列及载体pET28a(+)的序列特征，借助PrimerPremier5.0软件设计引物如下:

正向引物：5’CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT 3’，(包含一个BamH Ⅰ位点)，

反向引物：5’CCCAAGCTTTTATGCTGACACAGCATTT 3’，(包含一个HindⅢ位点)；

所述构建重组表达质粒是以克隆得到的dex-YG基因为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的克隆产品，将所述克隆产品用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切，酶切产品连接到载体pET28a(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG；

所述基因工程定点突变是以重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG为模板，先将473位的脯氨酸突变为丝氨酸，得到单突变体P473S，并提取其质粒作为模板，再将856位的脯氨酸突变为丝氨酸，得到双突变体P473S/P856S质粒，双突变体的引物设计如下：

P473S正向引物：5’AACAGTCCACTGACATCTGATGCTA 3’

P473S反向引物：5’ATGTCAGTGGACTGTTGACATAAGT 3’；

P856S正向引物：5’ACTGATGAAAATGCATCTGTGGCGTAC 3’

P856S反向引物：5’ATGCATTTTCATCAGTATCATAATA 3’；

所述宿主菌转化是将双突变体P473S/P856S质粒转化到E.ColiBL21(DE3)感受态细胞中，经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后，获得表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌dex-YG-thMU01。

4.由权利要求1所述的表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌制备耐热型右旋糖苷蔗糖酶的方法，包括接种、培养、诱导、破碎和分离各单元过程，其特征在于包括如下步骤：

将基因工程菌dex-YG-thMU01接种到含卡那霉素50μg/mL的50mL LB培养基中，在转速250r/min、37℃下培养16-19h，吸取2mL培养菌液加入至200mL A培养基中，转速250r/min、37℃下培养至菌浓度OD₆₀₀达到0.20-0.25时加入浓度为1mmol/mL的IPTG诱导剂，25-30℃下发酵诱导4-5h，离心分离得到菌体，向菌体中加入pH值为5.2-5.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，超声破碎，离心分离，上清液即为粗酶液，酶活达300-420U/mL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述A培养基中含有5g/L甘油、5g/L葡萄糖、0.1mmol/L MgSO₄·H₂O、10g/L蛋白胨、10g/L硝酸钾、17.105g/L Na₂HPO₄·12H₂O、3g/L KH₂PO₄以及1g/L NH₄Cl。

6.一种权利要求1所述的表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌的用途，其特征在于：是由所述基因工程菌发酵制备得到的耐热型右旋糖苷蔗糖酶在以蔗糖为底物制备右旋糖酐中的应用。