[发明专利]一种FcγRIIIA受体的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种FcγRIIIA(CD16)受体的ELISA检测方法。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。VEGF由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育中的正常细胞及组织中表达，在体内调节血管的通透性，为血管形成过程中的多种细胞提供一个纤维网络；在体外能促进基质的降解以及内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管腔样结构的形成，并可动员骨髓来源的内皮祖细胞。VEGF是诱导肿瘤血管形成的作用最强、特异性最高的血管生长因子。所以理论上来说，采用不同方法来干预或抑制血管内皮生长因子可以抑制肿瘤的生长。

单抗的功效不仅依赖于其抗体结合区域(Fab)，同时其可结晶区域(Fc)也发挥着重要作用。Fab能够特异地识别肿瘤相关抗原(TAA)，从而调控TAA相关的下游信号通路。Fc能够发挥一系列效应功能如ADCC、ADCP和CDC，进一步提升单抗的功效，尤其是FcγRIII与药物的ADCC活性直接相关，ADCC是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，当IgG抗体通过Fab段与靶细胞(病毒感染的细胞及肿瘤细胞)表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与有FcγR的杀伤细胞(NK细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞)等效应细胞结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞(病毒感染的细胞及肿瘤细胞)。

FcγRs主要包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)以及FcγRIII(CD16)。在这三种受体类型中，FcγRI与抗体的结合力最强，FcγRII和FcγRIII与抗体的结合力相对较弱。

FcγRIII的结构特征：50～70kDa糖蛋白，属Ig超家族成员，有2个C2结构，基因染色体位于1q23～24。识别FcγRIII代表性的McAb有HUNK2、Leu11、3G8、Gran1和B73.1等。FcγRIII结合人IgG、IgG3，为低亲和力受体。可分为FcγRIIIA和FcγRIIIB两种异型。①FcγRIIIA，穿膜结构，主要分布于巨噬细胞、NK细胞和嗜酸性粒细胞，巨噬细胞表达高水平，而单核细胞表达水平较低。②FcγRIIIB，通过GPI“锚”在中性粒细胞表面，每个人中性粒细胞表达10万～20万血液中可溶性的FcγRIIIB，中性粒细胞激活剂短时间处理后可明显降低FcγRIIIB的表达水平，可能与通过激活内源性蛋白酶切除GPI连接分子有关。

因此，抗体与Fc受体结合能力检测技术的创新与改进就显得尤为重要。近年来，生物膜干涉技术(biolayerinterferomeory，BLI)、biacore技术等被用于Fc受体结合活性的测定，虽然简便快捷，但需要价格昂贵的大型设备，不利于普通实验室、小型生物公司的技术研发及产品质量的跟踪监测。而酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法，因其操作简单、快速、敏感性高、特异性强、设备要求简单，因此在实验室广泛应用。

发明内容

本发明针对现有技术的抗VEGF单抗与FcγRIIIA受体的的结合能力较弱，用普通的ELISA方法做出的ELISA曲线不稳定。本发明创造性的将夹心法ELISA进行扩展，将受体-抗体-二抗的形式发展成受体-免疫复合物-二抗的形式，旨在提高抗体与FcγRIIIA的结合活性，提高Elisa检测方法的灵敏度、稳定性，能够得到完整的四参数曲线。创新性的利用夹心ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcγRIIIA受体的结合能力，使抗体样品体外与FcγRIIIA受体的结合活性的检测更加简单易行。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种用ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcγRIIIA受体的结合活性，即一种FcγRIIIA受体的ELISA检测方法，其包括在酶标板上包被FcγRIIIA受体的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，且所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物。

本发明优选的技术方案中，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.1～10:1之间；优选地，所述抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.5～5:1之间，更优选地，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在1～3:1之间。

本发明优选的技术方案中，将所述的免疫复合物进行梯度稀释，加入包被好FcγRIIIA的酶标板上进行孵育。

本发明优选的技术方案中，所述抗VEGF单抗为贝伐珠单抗(Avastin)。