[发明专利]一种FcRn受体的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种FcRn受体的ELISA检测方法。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。VEGF由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育中的正常细胞及组织中表达，在体内调节血管的通透性，为血管形成过程中的多种细胞提供一个纤维网络；在体外能促进基质的降解以及内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管腔样结构的形成，并可动员骨髓来源的内皮祖细胞。VEGF是诱导肿瘤血管形成的作用最强、特异性最高的血管生长因子。所以理论上来说，采用不同方法来干预或抑制血管内皮生长因子可以抑制肿瘤的生长。

抗VEGF单抗是采用重组DNA技术通过中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞表达系统生产的重组人源化单克隆IgG1抗体，包含93％的人源单抗序列和7％的可结合人VEGF的鼠源单抗互补决定区序列，重链由453个氨基酸组成，轻链由214个氨基酸组成，分子量大约为149kDa。治疗性单克隆抗体被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等治疗。单抗除具有特异性高、不良反应小和作用机制明确等特点外，半衰期长也是其独特的优势。当前的治疗性单抗大多为免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，其在体内半衰期主要受Fc段与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor，FcRn)亲和力的影响，亲和力降低或提高可导致单抗体内半衰期的缩短或延长，通过IgG-FcRn亲和力可以预测IgG的体内半衰期。因此，测定单抗与FcRn的亲和力可以作为评价单抗药代动力学的间接指标。近年来，单抗生物类似药以及Fc段改造和修饰类单抗不断涌现，评价该类单抗药物与FcRn亲和力的改变成为指导产品研发和生物类似药可比性研究的重要指标。IgG与FcRn的结合呈现pH依赖的特点，在溶酶体内的低pH值条件下(pH 5.5-6.5)，IgG与FcRn结合使IgG免于降解，待IgG-FcRn复合物返回细胞表面后，在中性体液条件下，结合力降低，IgG释放回体液中。

近年来，生物膜干涉技术(biolayerinterferomeory，BLI)、biacore技术等被用于FcRn受体结合活性的测定，虽然简便快捷，但需要价格昂贵的大型设备，不利于普通实验室、小型生物公司的技术研发及产品质量的跟踪监测。而酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法，因其操作简单、快速、敏感性高、特异性强、设备要求简单，因此在实验室广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是本发明创新性的利用夹心ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcRn受体的结合能力，使抗体样品体外与FcRn受体的结合活性的检测更加简单易行。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种用ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcRn受体的结合活性，即一种FcRn受体的ELISA检测方法,其包括在酶标板上包被FcRn受体的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，且所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物。

本发明优选的技术方案中，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.1～10:1之间；优选地，所述抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.5～5:1之间，更优选地，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在1～3:1之间。

本发明优选的技术方案中，所述样品配制步骤中,还加入肝素，且加入的肝素在反应体系的终浓度≥0.05U/mL，优选为加入的肝素终浓度为0.05U/mL～5.00U/mL；更优选地，加入的肝素终浓度为0.05U/mL～0.50U/mL。以此，在反应过程中，形成抗原-抗体-肝素的超级复合物，增加了受体亲和度。

本发明优选的技术方案中，在包被步骤中，还加入连霉亲和素包被缓冲液到酶标板，优选地，连霉亲和素浓度为0.1～10μg/ml。本发明中，通过加入连霉亲和素，能够增加受体包被处理量，即增加包被受体浓度。

本发明优选的技术方案中，将所述的免疫复合物进行梯度稀释，加入包被好FcRn的酶标板上进行孵育。

本发明优选的技术方案中，所述抗VEGF单抗为贝伐珠单抗(Avastin)。