[发明专利]一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体涉及一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法。

背景技术

白花兜兰具有很高的观赏价值，已经成为国际花卉市场上十分流行的高档花卉。白花兜兰新品种的选育成为新一轮花卉育种的热点，目前白花兜兰的新品种培育方法主要是杂交育种，但是杂交育种存在远缘杂交不亲和的缺点，难以打破物种之间的生殖隔离，以及在有性生殖过程中，由于重组时染色体的变换量小，难以打破某些基因连锁出现等缺点；并且通过杂交育种方法培育新品种的周期很长，某些优良性状难以保持，给改良某一单一性性状带来了极大的不便。近年来越来越多的花卉工作者利用转基因技术改变花卉的花色、花期、花型、香气等性状。但是白花兜兰的转基因技术体系到目前为止还没有成功的报道。

发明内容

为了克服上述白花兜兰转基因技术中存在的不足，本发明公开了一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法。

本发明是通过以下技术方案得以实现的。

一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，包括以下步骤：

a、白花兜兰液体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，再加入离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，制得白花兜兰液体培养基；

b、白花兜兰固体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，加入离子水定容至1L，再加入150g琼脂粉，搅拌均匀，于15psi高压下蒸汽灭菌20min后，置于冷水浴中，待培养基温度降到室温时加入500mg头孢氨苄毒素，充分摇匀，将培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外光照下光照15分钟后用封口胶封边，倒置，于4℃下保存；

c、农杆菌液体浸染液的配制；将带有基因转变质粒的农杆菌LBA4404培养至OD＝0.6～1.0，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清液，用100mg/L乙酰丁香酮的LB液体培养基悬浮沉淀，室温下静置3h，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清，用白花兜兰液体培养基悬浮沉淀，制得农杆菌液体浸染液；

d、白花兜兰浸染：选择生长良好、无病变的白花兜兰幼苗，灭菌，剪去茎尖和根部，置于农杆菌液体浸染液中浸泡10～20min，每隔2min摇匀一次；

e、白花兜兰暗培养：将上述浸泡后的白花兜兰幼苗挑出浸染液，用灭菌后的滤纸擦干表层液体，置于白花兜兰固体培养基中暗培养3天；

f、白花兜兰光照培养：将上述暗培养3天后的白花兜兰幼苗用500mg/L的头孢氨苄毒素清洗3遍，再用灭菌水冲洗5遍，最后用灭菌后的滤纸擦干后放到含有500mg/L的头孢氨苄毒素的白花兜兰固体培养基中进行光照培养；

g、结果检测：将浸染并培养两周后的白花兜兰用X-Gluc染色液在37℃恒温箱中浸泡3h，取出后用酒精脱色处理，能够产生肉眼可见的深蓝色化合物。

优选的，所述农杆菌LBA4404本身带有链霉素抗性和利福平抗性，培养温度为28℃，摇菌转速为180～220r/min，是一种弱毒的农杆菌，采用YEP培养基进行培养。

优选的，所述乙酰丁香酮的LB液体培养基的配制方法为：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，然后加入去离子水定容至1L，最后在15psi高压下蒸汽灭菌20min。

优选的，所述白花兜兰暗培养方法为在黑暗、室温条件下，将白花兜兰置于白花兜兰固体培养基中培养3天。

优选的，所述头孢氨苄毒素为头孢氨苄缓释片的液体溶液。

优选的，所述白花兜兰的光照培养方法为在光照强度5000Lux、温度24～26℃、湿度55～65％、二氧化碳浓度350～450ppm、光照时间12h/d的培养条件下温室培养，每30天继代一次。

优选的，所述X-Gluc染色液为β-葡糖醛酸酶基因检测的显色底物。