[发明专利]稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株及医用用途

说明书

本发明提供一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株及医用用途，采用改造鼠bmp7基因的方式构建bmp7基因序列，作为宿主的CHO细胞同样来源于鼠，其基因相容性和翻译效率大大提高，克服了利用CHO系统表达的BMP7蛋白的基因序列模板均来自人bmp7基因的现有技术存在的缺欠，避免了CHO细胞由于密码子偏好性难以高效转录和翻译人源基因序列；同时，本发明所采用的CHO‑S细胞是已经适应了无血清培养基的悬浮培养细胞，无需进行细胞株的悬浮驯化，有助于保持工程CHO细胞株的稳定性。本发明采用的技术手段对于BMP表达中以下关键性步骤：转录、翻译、折叠、前提切割、分泌、二硫键的配对和糖基化位点的糖型修饰，有明显效率提高的作用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株整合了经改造的鼠bmp7基因的CHO细胞株，为一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，同时还公开了其医用用途。

背景技术

骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs）是一类低种属特异性的蛋白质生长因子，具有多个亚型。BMPs能够诱导间充质细胞不可逆的分化为软骨和骨细胞。骨形态发生蛋白-7又称成骨蛋白-1（Osteogenic Protein-1，OP-1），在胚胎时期参与细胞的增殖、分化，调控肾、肠、骨等多种器官的形成和发育。成人BMP7主要在骨、肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达。

BMP7属于TGF-β超家族成员，其前体蛋白包括一个信号肽、一个前结构域和一个羧端结构域，经翻译后加工形成131个氨基酸残基的成熟肽，其活性形式为同源二聚体。除了形成同源二聚体，BMP7还会与其它同族BMPs形成异源二聚体，在诱导组织发育中具有重要作用。

研究表明，BMP7是一种多用途的蛋白，除了已经批准的胫骨骨折，BMP7的适应症可能还包括肾衰的治疗、中风后运动功能的恢复、矫形外科重建、口腔盖髓修复、骨质疏松症、软骨修复、帕金森病和Lou Gehrig氏疾病等。

天然BMP7以微量存在于皮质骨内，约为1-2μg/kg，其提取很困难且夹杂有其它物质。产量难以满足日益增长的科研和应用需要。

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是目前重组糖蛋白生产的首选体系，具有转录后修饰功能、胞外分泌功能、可悬浮驯化和较少的内原蛋白分泌等优势。但CHO细胞培养成本高，条件难掌握、易污染、表达水平较低。培养基中的血清成分是造成生产高成本的主要因素，血清价格昂贵、批间质量不一致、含动物源成分，大大增加下游纯化工艺的复杂性和成本。

发明内容

本发明的目的是提供一株整合了经改造的鼠bmp7基因的CHO细胞株，为一种高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，通过大规模培养该细胞株，可以表达和生产具有生物学活性的重组人BMP7蛋白。

本发明所述的一种稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株，其特征在于能高效表达重组人BMP7蛋白，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.1所示。

所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，包括以下几个步骤：

1）RT-PCR法提取鼠bmp7基因，通过定点突变得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，插入到pCHO1.0载体的多克隆位点，得到重组质粒；

2）将质粒转入悬浮CHO细胞中；

3）在CD-Forti+Puromycin+MTX筛选培养基中进行加压筛选，得到混合克隆细胞；

4）挑选单克隆细胞株，筛选得到高效表达重组人BMP7蛋白的CHO细胞株。

所述的稳定高效表达重组人BMP7的CHO细胞株的构建方法，其特征在于所述步骤1）包括以下几个步骤：