[发明专利]一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法

权利要求书

1.一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、样品采集：采集排便时间＜12h的大熊猫粪便；

b、样品预处理：将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中22～26h；

c、样品保存：取出b步骤浸泡后的粪便样品，干燥，转入底部铺满硅胶珠的离心管中，排尽瓶中空气。

2.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，b步骤中采用无菌镊子将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中24h。

3.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，c步骤中所述干燥温度为60～70℃，干燥时间为1.5～2.5h。

4.根据权利要求3所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，c步骤中所述干燥温度为65℃，干燥时间为2h。

5.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，c步骤中采用脱脂棉排尽瓶中空气。

6.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，所述样品保存之后还包括DNA提取及检测步骤。

7.根据权利要求6所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，所述DNA提取及检测步骤具体包括以下步骤：

Ⅰ、DNA提取：样品分别保存6个月、12个月、24个月后，用酚-氯仿抽提法提取大熊猫粪便的DNA；

Ⅱ、引物合成：采用PAGE纯化法合成引物，引物的上游序列为

ptp:5’CTCCCTAAGACTCAAGGAAG3’；

下游序列为p12s:5’TAGGAAGGCTAGGACCAAACC3’；

Ⅲ、PCR扩增：将步骤Ⅰ提取的DNA样品用合成的引物进行扩增；

Ⅳ、PCR扩增体系：1μL含Mg²⁺的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，0.4μL 10mM的上游引物，0.4μL 10mM的下游引物，0.1μL BSA, 0.1μL 5U/μL的rTaq酶，1μL基因组DNA，6.2μL灭菌超纯水；

Ⅴ、PCR扩增条件：95℃总变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共35个循环；最后72℃总延伸5分钟；

Ⅵ、扩增结果检测：扩增产物用1.5%的琼脂糖进行电泳检测；统计扩增成功样品，计算扩增成功率。

8.根据权利要求7所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，Ⅳ步骤中所述基因组DNA采用无菌超纯水、按照体积比1:10进行稀释。