[发明专利]点突变的基因型检测的方法及其试剂盒

权利要求书

1.用于非诊断目的点突变的基因型检测的方法，其特征在于：

所述方法是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；和

所述方法包括以下步骤：

针对待检测样本的每个点突变位点进行实时荧光定量PCR扩增：扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，当它分别与野生型或者突变型的检测序列相结合时，有不同的Tm值；和扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品，所述阳性质控品是所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒；和

根据待检测样本的每个点突变位点的实验Tm值TmE与出现的熔解曲线峰的个数，以及相应点突变位点的阳性质控品的野生型Tm值TmP1和突变型Tm值TmP2进行每个点突变位点的基因型的判读：

a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为突变纯合型；

b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型。

2.根据权利要求1所述的基因型检测的方法，其特征在于：所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒是将针对每个点突变位点分别PCR扩增出野生型的片段及突变型的片段后分别插入到相同质粒载体中进行构建；并且所述野生型的片段和突变型的片段的长度都长于所述检测序列的长度。

3.根据权利要求1所述的基因型检测的方法，其特征在于：在针对待检测样本的每个点突变位点进行实时荧光定量PCR扩增过程中，所述点突变位点进行不对称PCR扩增与所述阳性质控品的扩增是不在同一PCR扩增管中进行。

4.根据权利要求3所述的基因型检测的方法，其特征在于：所述待检测样本在一个反应管内可以进行多个突变位点的检测，和所有所述阳性质控品的扩增是在另一单管中进行，或者野生型阳性质控品与突变型阳性质控品分两个反应管进行。

5.根据权利要求4所述的基因型检测的方法，其特征在于：当进行PCR产物荧光检测时，每个点突变位点和其阳性质控品的检测是在同一检测通道中；和不同的点突变位点和其阳性质控品的检测是在不同的检测通道中或者是同一通道内的不同Tm值处进行。