[发明专利]马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法

权利要求书

1.马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、选择光照充足条件下培养2-3周的马铃薯组培苗叶片，在无菌条件下，将马铃薯组培苗叶片切划后，叶片正面朝下浸于酶解液内，26℃暗条件静置温育16-18h；酶解消化结束后，轻轻晃动培养皿，使原生质体从已酶解消化的叶片中释放到酶解液中；100目尼龙过滤网过滤后，将包含原生质体的酶解液转入无菌离心管中进行分离纯化，得待融合的马铃薯原生质体；所述酶解液为Japan Yakult的0.5％纤维素酶R-10和0.5％离析酶R-10的CPW酶解液，二倍体和四倍体分别酶解16h和18h；

S2、将所得的马铃薯原生质体分别漂洗后，再用漂洗液重悬并调整稀释至33.5×10⁴个/ml后，将两种原生质体等体积混合均匀；然后用移液器取等分量的800ul分别移至直径5cm的培养皿中，并静置5-10min；使原生质体粘附在培养皿底部；

S3、用移液器吸取PEG溶液，并滴加4-5滴到原生质体混合液上，确保PEG都覆盖粘附在底部原生质体；静置温育10-15min，随后，将培养皿倾斜45度，此时，原生质体依然粘附在培养皿底部，而PEG混合液流往皿边，再用移液器吸取PEG混合液；

S4、用漂洗液漂洗粘附在培养皿底部的融合原生质体，倾斜培养皿后去除漂洗液；重复漂洗一次；

S5、往培养皿中轻轻加入5ml改良KM培养基，用parafilm封口胶密封好培养皿；并置26℃条件下暗培养7天，随后转到光照12h/天培养箱中静置培养；

S6、培养20天后，用稀释培养基稀释10倍后，转移到直径9-10cm的培养皿中继续培养，培养条件为光照12h/天，26℃的培养箱；

S7、培养4-5周后，把生成的单个愈伤组织转接到愈伤组织再生培养基中，大约5周后，愈伤分化形成新植株。

2.如权利要求1所述的马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，所述步骤S1通过以下步骤完成分离纯化：

S11、离心含原生质体的酶解液500rpm，5min；弃上清液后，用23％(W/V)的蔗糖溶液重悬原生质体，再500rpm离心5min，弃上清；

S12、用含0.5mM甘露醇和0.5mM CaCl₂的漂洗液重悬原生质体，再500rpm离心5min收集原生质体，弃上清；重复以上漂洗液重悬、清洗、收集原生质体2次。

3.如权利要求1所述的马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，所述步骤S5中改良KM培养基为0.75mg/l Zeatin+0.1mg/l 2，4-D+1.0mg/l NAA。

4.如权利要求1所述的马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，所述步骤S6中稀释培养基为0.1mg/l 2，4-D+2.0mg/l6-BA。

5.如权利要求1所述的马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，所述步骤S7中的愈伤组织再生培养基为0.2mg/l Zeatin+2.0mg/l IAA。