[发明专利]一种牙髓干细胞复苏液及牙髓干细胞的复苏方法

权利要求书

1.一种牙髓干细胞复苏液的牙髓干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）牙髓干细胞的分离、培养及鉴定：收集健康患者牙齿，先用75%酒精擦拭牙体表面，再用含青霉素和链霉素的无菌PBS浸洗2次备用，在无菌条件下，利用裂钻环切牙齿，取出牙髓，剪成组织块，用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合酶在37 ℃环境中消化30 min，消化结束后吹散，离心收集细胞，接种于无菌培养皿中，滴加完全α-MEM培养基，放入37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中进行培养，5 d后更换第一次培养基，随后常规3 d更换一次培养基，待细胞融合达到80%-90%后，利用胰酶/EDTA常规消化细胞，传代，选取生长状态良好的第二代DPSCs，调整细胞浓度为1 × 10⁶个/mL，分装至1.5 mL的EP管中，分别加入适量的鼠抗人CD90、CD73以及CD14，室温避光将细胞与抗体的混合液孵育1 h，流式细胞仪检测；

（2）牙髓干细胞的冻存：第二代牙髓干细胞融合度达到80-90%以后，常规消化，1000rpm条件下离心5 min收集细胞，加入细胞冻存液吹散，然后将细胞以浓度为3 × 10⁶个/mL分装入细胞冻存管中，移入细胞专用冻存盒内，放入-80 ℃条件下过夜，最后转入液氮环境中进行长期冻存；

（3）DPSCs的复苏：选取在液氮中冻存3个月的牙髓干细胞，在37 ℃恒温水浴环境中快速解冻，然后利用常规α-MEM培养稀释，离心收集细胞，然后添加含有bFGF的牙髓干细胞复苏液，放入 37 ℃， 5% CO₂培养箱中进行培养，隔天更换一次培养基, bFGF作用的终浓度为 10-20 ng/mL，且bFGF只作用于复苏第一代的DPSCs，复苏第二代DPSCs培养基更换为常规干细胞培养基。

2. 根据权利要求1所述的牙髓干细胞的复苏方法，其特征在于，所述的步骤（1）中完全α-MEM培养基由20%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素组成。

3. 根据权利要求1所述的牙髓干细胞的复苏方法，其特征在于，所述的步骤（2）中细胞冻存液由10%DMSO + 90%FBS组成。

4. 根据权利要求1所述的牙髓干细胞的复苏方法，其特征在于，所述的步骤（3）中常规α-MEM培养由10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素组成。

5. 根据权利要求1所述的牙髓干细胞的复苏方法，其特征在于，所述的牙髓干细胞复苏液由间充质干细胞常规培养基和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组成，所述的间充质干细胞常规培养基由α-MEM 培养基+ 10-20% 胎牛血清+100 U/mL 青霉素+100 μg/mL 链霉素组成，所述的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 作用的终浓度为10-20 ng/mL。

6. 根据权利要求5所述的牙髓干细胞的复苏方法，其特征在于，所述的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 作用的终浓度为20 ng/mL。