[发明专利]用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应

说明书

本发明公开了一种扩增和检测多核苷酸的方法，该方法可以在相对短的时间内提供对来自临床样本的多种靶标的灵敏的、特异性的检测。

本申请是国际申请号PCT/US2009/039552，国际申请日2009年4月3日，中国申请号200980118968.1，发明名称为“用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应”的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年4月3日申请的美国临时专利申请号61/042,259的优先权权益。

发明领域

本发明总体上涉及用于扩增核酸的方法。更具体地，本发明涉及用于使用聚合酶链式反应来扩增多种核酸序列的方法。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)的开发使得能够使用DNA扩增用于多种应用，包括分子诊断测试。然而存在许多与PCR用于分子鉴别诊断(MDD)测定的应用相关的挑战。PCR利用特异性的引物或引物组、温度条件和酶。PCR反应可能容易被污染，引物结合对于不同的引物可能需要不同的条件，引物应该对于靶序列特异以便仅扩增该靶序列，等等。这使得其更难以从单个样品中扩增多种序列。

过去，诊断测试临床样品以发现一种或多种疾病病原体需要分离和培养微生物。然而，这可能需要几天，并且在许多情况下，如果要挽救患者的生命，诊断必须在几小时内作出。分析单个临床样品以鉴定多种生物体从而确定哪一种或哪几种可能是疾病的(多种)病原体是期望用于MMD的方法，并且已经开发了许多方法来较好地实现该目标。例如，已经开发了多重PCR法以扩增样品内的多种核酸以便产生足够的DNA/RNA从而能够检测和鉴定多种生物体。然而，多重PCR具有一些缺点。例如，多重PCR反应中的每种靶标需要其自己的最佳反应条件，因此增加靶标的数目需要每种单个靶标的反应条件不是最佳条件。此外，体系中的多组高浓度引物经常产生引物二聚体或获得非特异性的本底扩增。这种特异性的缺乏也需要PCR后提纯和多次杂交后洗涤的额外步骤。密集的引物由于需要利用酶和消耗底物而降低扩增效率。扩增效率的差异可能导致扩增子产量的显著差异。例如，一些基因座可能非常有效地扩增，而另一些则扩增的效率很低或根本不能扩增。这种不均一扩增的可能性也使得难以至不可能准确地进行终点定量分析。

一种方法利用以非常低的浓度使用的嵌套式基因特异性引物以在初始PCR循环期间富集靶标。之后，使用共用引物来扩增所有靶标。整个反应在一个试管中进行，不需要额外轮次的PCR，并且不需要专门的仪器，但代替地，可以使用常规的热循环仪来进行。然而，此方法有缺点。例如，因为使用低浓度的引物在初始循环期间富集靶标，因此测定的灵敏度最终降低，初始的富集循环的每次循环需要较长的退火时间，并且在经过扩增靶标所需的循环次数后酶很有可能变得不太有效。

对于更灵敏的、更快速的和更有效的用于扩增来自多种靶标的DNA和/或RNA以促进那些靶标的快速鉴定的方法仍然存在着需求。

发明概述

本发明涉及用于扩增核酸从而能够检测那些核酸的方法，该方法包括以下步骤：在第一次扩增反应中使用高浓度、靶标特异性引物扩增一种或多种靶核酸，从而产生至少一种含有至少一个共用引物结合位点的核酸扩增子；拯救所述至少一种核酸扩增子；以及在第二次扩增反应中使用与所述至少一个共用引物结合位点结合的共用引物扩增所述至少一种核酸扩增子。本发明的一个方面利用嵌套式靶标特异性引物。靶核酸可以包括DNA和/或RNA，并且可以包括病毒、细菌和/或真菌来源的DNA和/或RNA，以及人或其他动物来源的基因组DNA和/或RNA。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)和/或RT-PCR进行。靶核酸的来源可以是来自一份或多份临床、环境、或食品样品，并且该方法可以以广泛多样的方式使用，包括，例如，临床诊断、环境采样、植物检测、食品安全性分析、检测遗传病症、和/或检测疾病状况。该方法可以用于人和/或兽的医学诊断。