[发明专利]蔓越桔的化学成分标准指纹图谱及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种蔓越桔化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1）称50 g±0.5 g蔓越桔果实放入溶剂搅拌机中，加入50 mL提取溶剂，匀化样品直至获得均质匀浆，时间不超过20秒；

2）将布氏漏斗连接上真空泵，使匀浆穿过烧结玻璃漏斗，所得滤液即为蔓越桔果实花青苷的抽提液，将抽提液储存在棕色不透光的试剂瓶里，-20 °C保存；

3） 使用高效液相色谱，经过 C18 反相色谱柱分离，使用二极管阵列检测器在525 nm检测；色谱分析条件为：流速0.8 mL·min–1，柱温35°C，进样体积10 μL，200–800 nm范围内全波长扫描吸收光谱，流动相A相为5%甲酸水（v/v）；B相为15%甲醇乙腈（v/v）；

4）线性洗脱程序：0 min，5%B；40 min，16%B；45 min，5%B；

5）将蔓越桔各个品种的花青苷制成标准样品溶液在上述步骤3）和步骤4）操作条件下注入进行梯度洗脱即得蔓越桔化学成分标准指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种蔓越桔化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的蔓越桔果实为已成熟果实。

3.根据权利要求1所述的一种蔓越桔化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的提取溶剂为含有0.2%甲酸的甲醇，配制方法为：

①移取2 mL甲酸加入1L甲醇中，可获得1L该溶剂；

② -20°C储存备用。

4.采用权利要求1-3任意一项所述的蔓越桔化学成分标准指纹图谱的构建方法构建得到的蔓越桔化学成分标准指纹图谱。

5.权利要求4所述的蔓越桔化学成分标准指纹图谱在蔓越桔各个品种辨别方面的应用。

6.根据权利要求5所述的蔓越桔化学成分标准指纹图谱在蔓越桔各个品种辨别方面的应用，其特征在于，应用方法为：

1）提取蔓越桔果实中的花青苷；

2）对花青苷进行定性分析；

（1）HPLC-DAD分析方法

分析条件：流速0.8 mL·min^–1，柱温35°C，进样体积10 μL，200–800 nm范围内全波长扫描吸收光谱，花青素苷的检测波长为525 nm；流动相A相为5%甲酸水（v/v）；B相为15%甲醇乙腈（v/v）； 线性洗脱程序：0 min，5%B；40 min，16%B；45 min，5%B；

（2）HPLC-ESI-MS²定性分析：

液相色谱分析条件、流动相组成与洗脱程序与（1）中所述相同：质谱分析条件：电喷雾离子化，离子阱分析器，正离子模式，全离子扫描，扫描范围m/z： 100–1000 u，毛细管电压4000 V，喷雾器压力35 psi，干燥气（N₂）流速为8 L·min^–1，干燥温度350°C，毛细管出口电压为120.4 V，毛细管偏移电压为77.2 V；利用LC/MSD Trap软件，根据裂解的碎片离子分析质谱结果，对花青苷进行定性分析

3）对花青苷进行定量分析

（1）标准品配制：利用分析天平，称取5 mg矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品，溶解于5 mL 甲醇中，得到5 mL 浓度为1 mg mL^–1 的母液；用移液器分别吸取标准母液500、250、125、62.5、31.25 μL置于5 mL微量离心管中，分别加入1500、1750、1875、1937.5、1968.75 μL甲醇，得到浓度0.05625至1.0 mg/mL的标准品溶液，利用HPLC-DAD中的分析方法对标准品进行分析，以峰面积对浓度作标准曲线；

（2）花青苷相对含量计算：按照以下算式进行计算：X=C1×V/100m

式中： X—样品中花青苷的相对含量，单位为毫克每百克（mg 100g^–1）； C1—从标准曲线上得到的浓度，单位为毫克每毫升（mg mL^–1）； V—抽提液的体积，单位为毫升（mL）； m—蓝莓果实的质量，单位为克（g）；

4）根据花青苷的含量得出结论。