[发明专利]促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法。

背景技术

罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，本课题组前期根据罗汉果转录组数据，已推导出甜苷V可能的生物合成途径。罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶的作用下，形成罗汉果甜苷V。

异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，CYP450酶基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达CYP450酶基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制CYP450酶基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。然而，CYP450酶基因是个超基因家族，本课题组前期研究发现，CYP81Q67与罗汉果甜苷V的合成途径有一定关联。现有技术中未见有促进罗汉果CYP81Q67基因表达来提高罗汉果中甜苷V含量的报道。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种通过茉莉酸甲酯处理罗汉果组培苗或其果实来促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，为有效促进罗汉果中甜苷V含量积累奠定基石。

本发明还有一个目的是提供一种通过对罗汉果组培苗根系处理与花粉处理进一步促进罗汉果CYP81Q67基因表达来提高罗汉果甜苷V含量的方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，将罗汉果组培苗接种于诱导培养基中诱导培养至少30天，其中，诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为50-400μmol/L。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，所述诱导培养的条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，诱导培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50-400μmol/L，灭菌并冷却至24-26℃。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，所述诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为200-250μmol/L。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒5天，所述诱导液中含有浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，所述诱导液中含有浓度为100-150μmol/L的茉莉酸甲酯。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，所述诱导培养基中还包括有0.3mg/L油菜素甾醇和0.04mg/L独角金内酯。

优选的是，所述的促进罗汉果CYP81Q67基因表达的方法，所述组培苗经所述诱导培养之前经过根部处理，所述根部处理具体包括：

将组培苗根系中根长小于最长根长度1/4的短根剪除，再将2-3条粗壮根用无菌刀分别划2-3个伤口，伤口深度小于0.2mm，再用经过预浸泡处理的玉米须包覆组培苗的根系，连续变温处理10-12次，然后将组培苗上的玉米须去除，置于100-200高斯磁场中磁化处理1h；

每次变温处理均为将根系包覆有玉米须的组培苗先置于2℃下贮存1min，再置于25℃下贮存5min；