[发明专利]检测水中铜绿假单胞菌和ExoY的引物、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种检测水中铜绿假单胞菌及基因ExoY的引物，其特征在于该引物和探针组合的序列分别为：

上游引物P.AF:TGGTAGTCCACGCCGTAAA

下游引物P.AR:CAGACTGCGATCCGGACTACG

探针P.AP:TCGACCGCCTGGGGAGTACG

上游引物ExoYF：GTCTCTACAGGATCAGCCGC

下游引物ExoYR：TGCGCATCAGACCTTACGTT

探针ExoYP：GGCAACTGGTGGACGCCCTC。

2.一种检测水中铜绿假单胞菌及基因ExoY的试剂盒，其特征在于该试剂盒中反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10.0μL，铜绿假单胞菌和ExoY正反向引物各0.01-1.0μL、探针各0.01-1.0μL，DNA模板4.0μL。

3.一种检测水中铜绿假单胞菌及基因ExoY的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、提取样品DNA；

B、将各反应组分加入上述如权利要求2所述的反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取所述试剂盒中的阳性质控、和阴性质控，按照与步骤A相同的方法处理，得到相应的DNA模板；

C、将制备数字PCR混合液制作为油包水PCR微反应,并全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应；

D、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每PCR反应管中微滴的PCR反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的一种检测水中铜绿假单胞菌及基因ExoY的方法，其特征在于步骤C中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：

(1)94℃预变性3min；

(2)94℃变性10s，58.5℃退火1min，共进行40个循环；

(3)98℃酶热失活10min；

(4)4℃停止反应。

5.根据权利要求3所述的一种检测水中铜绿假单胞菌及基因ExoY的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：

50mL水样直接10000rpm立心10分钟，或者取50mL水样通过滤膜过滤，用镊子夹取滤膜在50mL的离心管用2ml超纯水冲洗后再10000rpm离心10分钟，去上清；加入5mL CTAB提取液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；后8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μL氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μL到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μL NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μL 70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μL TE溶液中。