[发明专利]猪NDEL1基因分子标记在肉质检测中的应用

说明书

技术领域：

本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及一种多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法，此方法涉及猪肉质性状的分子辅助育种。

背景技术：

猪肉是我国城乡居民动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉品需要量的增加，对肉质的要求也相对提高。而肉质主要是由微效多基因控制，并存在主基因效应。分子生物技术的发展，尤其是近年来基因组测序技术的发展，使得人们可以在DNA水平寻找控制肉质性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，并在育种过程中将其应用于标记辅助选择，以提高选择进程，更好地改善猪肉质性状，满足人们的需要，以获得更大的经济效益。

肉质定义最为广泛接受的是Hoffmarm的定义，即肉质应该考虑感官属性、营养价值、技术质量和食品安全。感官属性指外观(如色泽)、保水力、硬度，食用品质指嫩度、多汁性、风味与滋味、臭味、大理石纹，营养价值指脂肪含量、脂肪酸组成、蛋白质含量、其它营养含量，技术因素指系水力、脂肪硬度、组织分离、氧化稳定性，社会质量指动物福利、环境，食品安全指微生物卫生(无沙门氏菌、弯曲杆菌)、无残留(抗生素、重金属、杀虫剂)。

分子生物技术的发展和猪高密度基因图谱的构建，使育种工作者可在DNA水平上寻找影响肉质性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，理论上这些主基因或分子标记一经确认，就可进行标记辅助选择育种。

NDEL1基因全名是nudE neurodevelopment protein 1like 1(由Hugo基因命名委员会命名)，编码一种巯基活性寡肽酶，该酶在细胞周期的M期被磷酸化，而磷酸化调节该蛋白在细胞周期中的分布，在细胞间期，一部分DNEL1蛋白与细胞中心体结合，有丝分裂期进一步结合到纺锤体上。该基因位于人(Homo sapiens)17号染色体p13.1，小鼠(Mus musculus)11号染色体B3，大鼠(Rattus norvegicus)染色体10q24，黄牛(Bos taurus)19号染色体，鸡的(Gallus gallus)18号染色体。

但是，目前国内外关于猪NDEL1基因的相关研究没发现相关报道。该蛋白与细胞周期素依赖蛋白激酶通路互作，可能进一步影响猪肌肉中的肌纤维的运动影响失水率，进一步影响肉的品质。

发明内容：

本发明的目的在于寻找NDEL1基因的突变位点，以及作为猪肉质性状基因多态性的检测方法，该方法为肉质性状辅助育种提供一种有用的分子标记。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：本发明所述的DNEL1基因如SEQ ID NO:1所示的509bp处有一个T/C的碱基突变DNEL1基因的一个C/T的单核苷酸多态性引起，导致PCR-RFLP-Taq I多态性，出现TT型、TC型和CC型。由屠宰率来看，CC型显著性低于TC型和TT型(P<0.05)，而TT型和TC型之间不存在显著性差异(P>0.05)。在眼肌面积和失水率方面，TT基因型与CC型和TC型呈显著性差异(P<0.05),本发明为猪肉质性状标记辅助选择提供了新的分子标记。

上述DNEL1基因的多态性是以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用SSCP技术和测序技术发现SNP，并利用PCR－RFLP进行基因分型，再利用SAS软件通用线性模型(General Linear Model,GLM)分析SNP与肉质性状的关联。

本发明制备了检测SEQ ID NO:1所示的DNEL1基因片段突变的引物对，所述引物序列为：

正向引物为5′-TGGCGATGTCGGGAACCT-3′。

反向引物为5′-CACAGCAACACCCAAGCA-3′。

利用上述引物对进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用限制性内切酶Taq I对PCR产物进行酶切鉴定，最后用2％琼脂糖凝胶电泳检测TT、CC和TC基因型。

利用上述制备的与猪肉质性状相关的分子标记对外来猪种和中国地方品种进行了关联分析的应用，从而完成了本发明。

SNP发现与检测方法建立：申请人设计了扩增包含该SNP引物，NDEL1基因引物扩增的PCR产物经过限制性内切酶Taq I酶切后产生3个不同长度大小的片段，分别为1177bp、509bp、668bp。经过2％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，只有一条电泳条带的是TT基因型，大小为1177bp；两条带的是CC基因型，大小分别为509bp和668bp；三条带的是TC基因型，大小分别是509bp、668bp和1177bp。