[发明专利]一种双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表面表达特异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ以及特异性嵌合抗原受体PD-L1-4-1BB；

所述的特异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的特异性嵌合抗原受体PD-L1-4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的特异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的特异性嵌合抗原受体PD-L1-4-1BB的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，

所述的特异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ由CD8α信号肽、EGFRvIII抗体轻链可变区、linker区、EGFRvIII抗体重链可变区、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区和免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ串联组成；

所述的特异性嵌合抗原受体PD-L1-4-1BB由CD8α信号肽、PD-L1抗体轻链可变区、linker区、PD-L1抗体重链可变区、人4-1BB铰链区、人4-1BB跨膜区和4-1BB胞内信号区串联组成。

3.根据权利要求2所述的双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，

所述的特异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ中，CD8α信号肽的编码核苷酸序列如SEQID NO.9所示；EGFRvIII抗体轻链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；Linker区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；EGFRvIII抗体重链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；人CD8α铰链区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；人CD8α跨膜区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；免疫受体络氨酸活化基序CD3ζ的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

CD8α信号肽基因的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；PD-L1抗体轻链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；Linker区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；PD-L1抗体重链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；人4-1BB铰链区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；人4-1BB跨膜区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；4-1BB胞内信号区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

4.权利要求1～3任一项所述的双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)获取特异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ以及PD-L1-4-1BB的核酸序列；

(2)将异性嵌合抗原受体EGFRvIII-CD3ζ以及PD-L1-4-1BB的核酸序列分别克隆到表达载体中，获得EGFRvIII-CD3ζ以及PD-L1-4-1BB表达质粒；

(3)将表达质粒转染至293T细胞；包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得的慢病毒浓缩液；

(4)慢病毒浓缩液感染T淋巴细胞从而获得双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的表达载体包含能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4的编码基因。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的表达载体慢病毒载体pCDH-EF1α-GFP或pCDH-EF1α-RFP；获得pCDH-EGFRvIII-CD3ζ以及pCDH-PD-L1-4-1BB质粒。

7.权利要求1～3任一项所述的双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为EGFRvIII以及PD-L1表达阳性的肿瘤。