[发明专利]用于检测MTHFR基因多态性的引物对、探针及试剂盒

说明书

本发明公开一种用于检测MTHFR基因多态性的引物对、探针及试剂盒；所述试剂盒包括有：针对MTHFR基因c.677位点设计的碱基序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物，所述SEQ ID No.1的5’端第一个碱基具有氨基修饰基团，所述SEQ ID No.2的5’端第一个碱基具有氨基修饰基团；针对MTHFR基因c.677位点设计的碱基序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针，所述SEQ ID No.3的一个碱基具有氨基修饰基团，所述SEQ ID No.4的一个碱基具有氨基修饰基团。与现有技术相比，本发明试剂盒可以显著缩短检测所需时间，减少非特异性扩增，可以检测SNPs和点突变，降低设计难度和检测成本,并且不影响诊断精度，实现单一反应管无开盖检测突变的方法，最大限度的避免气溶胶污染，方便临床使用，减少操作导致的误差。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测MTHFR基因多态性的引物对、探针及试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。荧光PCR(qPCR)检测，是在PCR技术基础发展的实时检测技术，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析或根据荧光信号累积检测目标基因。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，到21世纪初已得到广泛应用。

PCR检测方法虽然具有快速特点，但是其快速是相对于其他检查，如培养，目前国内外门诊检测越来越需要更快出结果，而目前的PCR技术每个循环需要加热冷却，达到快速PCR目的的方法主要集中在缩短加热冷却时间，缩短时间效果有限，PCR反应本身需要每个循环75秒左右时间，为了缩短检测时间，只能减少循环数，导致快速PCR灵敏度降低。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,SNPs作为第三代遗传标记，具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定，SNPs还影响机体的生理特征、药物代谢能力、病理条件,常用于研究或诊断疾病的易感性、个性化医疗，比如MTHFR基因677位点的SNPs与叶酸代谢相关，以MTHFR677位点野生型C/C纯合子代谢叶酸能力为100％时杂合子C/T型的代谢能力为65％，突变型纯合子T/T代谢能力为30％，而叶酸代谢和同型半胱氨酸代谢密切相关，和先天性畸形、高血压等疾病关系密切。

点突变是基因突变的一种，指只有一个碱基对发生改变。广义点突变可以是碱基替换，单碱基插入或碱基缺失；狭义点突变也称作单碱基替换(base substitution)。碱基替换又分为转换(transitions)和颠换(transversions)两类。点突变具有很高的回复突变率。

点突变和肿瘤发生关系密切,如非小细胞肺癌-腺癌患者中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor:EGFR)基因出现突变患者占据30％多,随着靶向药物的出现,检测靶向药物有效突变可以有效地分配医疗资源,使医疗有的放矢,减少浪费。

目前检测SNPs或点突变的方法主要有：1)PCR-SSCP法；2)异源双链分析法(HA)；3)突变体富集PCR法(mutant-enriched PCR)；4)等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO)；5)DNA芯片技术(DNA chip)；6)突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)；7)焦磷酸测序法等方法。