[发明专利]基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板以及试剂；其中，酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括抗三唑磷纳米抗体、三唑磷标准溶液、酶标记的二抗、缓冲液PBS、洗涤液PBST、底物液、显色液和反应终止液等。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。本发明的优点是能准确灵敏地检测水、蔬菜中三唑磷残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。

技术领域

本发明涉及基因工程、噬菌体展示技术以及ELISA检测技术领域，具体地说，涉及基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

三唑磷(Triazophos)是一种应用较为广泛的有机磷酸酯类杀虫剂，对危害粮、棉、油、果蔬、茶叶等主要农作物的害虫都有良好的防治效果。三唑磷对鱼类、蜜蜂、家蚕毒性较大，对哺乳动物的毒性中等，其进入人体后会造成大量乙酰胆碱蓄积在神经效应器接点处，发生毒蕈碱样、烟碱样及中枢神经系统症状。

在甲胺磷、对硫磷等高毒有机磷杀虫剂被限制或禁止使用之后，三唑磷的使用量近年来迅速增加，由于半衰期较长、易残留，环境和食品中残留超标问题逐渐引起关注。因此，加强三唑磷残留的检测，对于科学合理地使用三唑磷，保障食品安全和人类健康，减少环境污染，增强我国农副产品的国际竞争力，保持我国农业的可持续发展等具有重要意义。

目前已报道的三唑磷残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和色谱-质谱联用(GC/LC-MS)。运用这些方法需要专业化的实验室、专用仪器设备及专业操作人员，样品前处理复杂，分析成本高，难以满足大量样本现场快速监测的需要。20世纪90年代以来，快速发展的免疫分析技术已被应用于农药残留分析和环境监测，具有简便快速、廉价高效、特异性强、灵敏度高等优点。

基于常规抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的三唑磷残留酶联免疫吸附分析方法稳定性相对较低，本发明以抗三唑磷纳米抗体为基础，采用酶联免疫吸附分析方法，其热稳定性均优于多克隆抗体免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的是针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等不足，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，分析三唑磷残留的ELISA检测试剂盒。适用于水、蔬菜等样品中三唑磷残留的快速测定。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一条用于构建驼科动物噬菌体展示纳米抗体文库的C端通用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

继而本发明提供提供一种抗三唑磷纳米抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将SEQ ID NO:1所示序列去掉末端6个组氨酸标签后的氨基酸序列。

所述抗三唑磷纳米抗体可以按如下方法进行制备：利用化学反应合成三唑磷的半抗原O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯，将半抗原与钥孔血蓝蛋白KLH偶联后作为免疫原，免疫实验动物骆驼，提取外周血淋巴细胞的总RNA，经反转录及巢式PCR，克隆出纳米抗体重链(VHH)基因片段，通过酶切连接，将基因片段克隆至噬菌粒载体，高效电转化至大肠杆菌，经辅助噬菌体拯救，构建得到噬菌体纳米抗体库，筛选出特异的三唑磷噬菌体纳米抗体，将其表达纯化，得到灵敏度高、特异性强的抗三唑磷纳米抗体。制备的纳米抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达。