[发明专利]基于体外反应体系筛选黄曲霉SUMO化靶蛋白的方法

权利要求书

1.一种黄曲霉SUMO化酶系的体外反应体系，其特征在于：该体系由SUMO化反应溶液体系组成，其中包含了由修饰分子AfSumO、SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB、SUMO E2结合酶AfUbcI、SUMO E3连接酶分别经过原核表达后得到的重组蛋白，以及待检测的蛋白或药物；

所述的原核表达的黄曲霉SUMO化酶系中的修饰分子AfSumO，其编码序列选自：核苷酸编码序列SEQ ID No. 1，蛋白序列SEQ ID No. 2；

所述的SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB，其编码序列选自：核苷酸序列SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，分别对应的编码蛋白序列SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6；

所述的SUMO E2结合酶AfUbcI，其编码序列选自：核苷酸序列SEQ ID No. 7，其编码的蛋白序列SEQ ID No. 8；

体系中的所选取的SUMO化酶系中的SUMO E3连接酶选自AfSizA，其编码序列选自： 核苷酸编码序列SEQ ID No. 9，其编码的蛋白序列SEQ ID No. 10。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉SUMO化酶系的体外反应体系，其特征在于：所述的SUMO化反应溶液体系含有如下成分：pH 7.0-7.4、10-100 mM HEPES，0-300 mM NaCl，5-20 mMMgCl₂，0-0.5 mM dithiothreitol，0-50μg/mL bovine serum albumin Fraction V，1-20mM ATP，0.1-50 μg/mL重组AfSumO，0.1-50 μg/mL重组AfAosA，0.1-50 μg/mL重组AfUbaB，0.1-50 μg/mL重组AfUbcI以及0.1-50 μg/mL重组SUMO E3连接酶。

3.根据权利要求1或2所述的黄曲霉SUMO化酶系的体外反应体系，其特征在于：体系中的所选取的酶组分，包括修饰分子AfSumO，SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB，SUMO E2结合酶AfUbcI， SUMO E3连接酶，都是将其编码序列克隆入原核表达载体进行原核表达，并利用载体上的亲和标签进行纯化获得的具备相应体内活性的高纯度重组蛋白。

4.根据权利要求1所述的黄曲霉SUMO化酶系的体外反应体系，其特征在于：所述SUMO化体外反应条件如下：4-37℃下反应5至120min。

5.一种筛选SUMO化靶标蛋白的方法，其特征在于：基于权利要求1或2所述的黄曲霉SUMO化酶系的体外反应体系，并结合体外展示技术，在体外对潜在的SUMO化靶标进行不同通量的筛选及鉴定。

6.根据权利要求5中所述的一种筛选SUMO化靶标蛋白的方法，其特征在于：包括以下：

（1）不同通量的待检测蛋白的表面展示文库构建；

（2）表面展示文库与SUMO化体外反应体系共同反应；

（3）利用SUMO化酶系中的修饰物SumO的亲和标签所对应的亲和介质，对体外反应体系中的游离SumO和发生SUMO化修饰的蛋白及其偶联的遗传信息进行富集和多轮淘选；

（4）通过检测筛选的SUMO化修饰的蛋白所偶联的遗传信息，鉴定潜在的SUMO化靶标蛋白。