[发明专利]人源绦虫ep45基因的通用引物及其鉴别方法有效
申请号: | 201710647928.2 | 申请日: | 2017-08-01 |
公开(公告)号: | CN107326082B | 公开(公告)日: | 2020-12-15 |
发明(设计)人: | 骆学农;刘光学;梁盼红;张少华;才学鹏 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
主分类号: | C12Q1/6888 | 分类号: | C12Q1/6888;C12Q1/686 |
代理公司: | 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 | 代理人: | 席勇 |
地址: | 730010 甘肃*** | 国省代码: | 甘肃;62 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 绦虫 ep45 基因 通用 引物 及其 鉴别方法 | ||
本发明涉及分子生物技术领域,公开了一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物、核苷酸序列及其鉴别方法。该引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物;其中,SEQ ID NO:1:5’‑AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG‑3’;SEQ ID NO:2:5’‑GGGGCTCAGGCACCTTGAT‑3’;本发明的实施方式通过设计三种人源绦虫ep45基因的通用引物,RT‑PCR扩增获取绦虫的ep45基因片段,然后根据三者ep45之间限制性内切酶位点的差异,用EcoR I和/或Aar I进行酶切处理,根据酶切产物电泳出现图谱的差异(1条/2条/3条带)对三种人源绦虫进行种间鉴定,大大缩短了PCR产物测序鉴定的时间,而且根据酶切图谱的判定结果更准确、可靠。
技术领域
本发明涉及分子生物领域,特别涉及一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物、核苷酸序列及其鉴别方法。
背景技术
猪带绦虫(Taeniasolium)、亚洲带绦虫(Taeniaasiatica)和牛带绦虫(Taeniasaginata)是重要的人兽共患寄生虫,均寄生于人的小肠内,引起人的绦虫病甚至囊虫病。因此,种类的鉴别在绦虫病/囊虫病的相关研究和综合防治中具有重要意义。由于寄生于人肠道的三种绦虫虫体形态非常相似,三者之间最主要的区别在于头节上有无顶突和小钩。因此,传统的方法都是通过头节的压片后显微镜观察加以区别。但遗憾的是排出体外的虫体常缺失头节,单纯依靠节片或虫卵很难进行鉴别,通常需进行分子生物学方法的鉴定。最常用的鉴别方法是通过PCR分别扩增三种虫体的18s或线粒体基因序列,然后进行测序分析,根据目的序列的差异进行鉴定。但该方法的缺点是测序比较费时,而且当序列相似性很接近时(杂交种),无法进行准确的种间鉴定。
发明内容
本发明实施方式的目的在于提供一种三种人源绦虫的鉴别方法,不但克服了传统显微镜检查的缺点,而且通过通用引物进行单基因的PCR扩增和酶切鉴定,无需进行基因测序即可实现等绦虫的分子鉴定,大大加快了绦虫鉴定的速度,同时通过酶切图谱比较的方法,使得绦虫的鉴定结果更加准确、可靠。
为解决上述技术问题,本发明的实施方式提供了一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物,该引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物;其中,SEQ ID NO:1:5’-AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG-3’;SEQ ID NO:2:5’-GGGGCTCAGGCACCTTGAT-3’。
本发明的实施方式还提供了一种三种人源绦虫ep45的核苷酸序列,三种人源绦虫为猪带绦虫、牛带绦虫以及亚洲带绦虫;猪带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQ ID NO:3;牛带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQ ID NO:4;亚洲带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQID NO:5。
本发明的实施方式还提供了一种三种人源绦虫的鉴别方法,该方法包括以下步骤:
(1)提取三种待鉴别人源绦虫的总RNA,通过所述的通用引物对总RNA进行反转录,合成待鉴别人源绦虫的cDNA;
(2)以待鉴别人源绦虫cDNA为模板进行ep45基因PCR扩增;
(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,然后进行胶回收;得到ep45胶回收产物;
(4)使用EcoRI和/或AarI限制性内切核酸酶对ep45胶回收产物进行酶切处理;
(5)对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱对人源绦虫进行鉴定。
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