[发明专利]野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因的检测引物

说明书

本发明提供了一种基于qRT‑PCR鉴定野生稻响应稻褐飞虱取食后体内激素信号相关基因转录量变化的若干引物序列，该引物跨基因内含子设计，确保只扩增野生稻cDNA上的相应序列。利用本发明提供的特异性、跨内含子的引物可实现对野生稻响应稻褐飞虱取食后激素信号相关基因转录水平变化的准确检测，可有效去除核基因扩增的污染，为野生稻响应稻褐飞虱取食的分子机理研究提供了可靠的方法。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，尤其涉及野生稻经稻褐飞虱取食后体内激素信号相关基因转录水平的检测。

背景技术

稻褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal.)属同翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)昆虫，是我国和亚洲水稻生产中的主要害虫。褐飞虱危害水稻途径可分为二个方面，直接危害和间接危害。直接危害是褐飞虱成虫、若虫直接吸食水稻造成的危害，在稻丛下部刺吸汁液，消耗稻株养分。研究发现，水稻受褐飞虱取食后，组织中化学成分改变，叶绿素、可溶蛋白含量、蛋白酶活性和水分均降低，严重时水稻倒伏、枯萎，造成减产。间接危害是褐飞虱产卵刺伤植物组织以及传播或诱发水稻其他病害的发生。如何防止褐飞虱的大规模爆发和提高栽培稻在逆境胁迫下的产量和质量，一直是科研工作者的研究目标。杀虫剂技术难度大、成本高且污染环境，所以研究水稻抗虫的分子机理，筛选克隆抗性基因，改良栽培稻品种，是提高水稻抗虫十分必要的方法。

在自然环境中，植物持续暴露于各种非生物和生物胁迫中。为了生存，植物进化出了错综复杂的机制来感知外界信号，并选择最优的应对方式。当植物感知到这些胁迫后，体内的激素、活性氧、激酶和相关的转录因子会相互配合组成响应的网络，来帮助植物应对这些外界的胁迫。昆虫取食植物诱导植物细胞里发生一系列分子事件，转换成警报信号，然后产生并富集一些防御性的代谢产物。植物对昆虫取食的诱导型防御分为三个阶段，感知阶段、信号传递阶段和代谢产物的生物合成阶段。一些小分子和蛋白已被发现并认为在抗虫防御信号传递阶段起重要作用，包括Ca²⁺、蛋白激酶(MAPKs)、活性氧族(ROS)和植物激素。植物激素在植物响应外界胁迫的传递网络中扮演着至关重要的角色，这些激素信号错综复杂、相互协同或拮抗，共同调节植物对外界环境的应答。参与抵御生物胁迫的激素主要包括水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)。

发明内容

结合目前研究和前期工作，本发明人在两种野生稻中利用数字表达分析谱筛选了经褐飞虱取食后，转录水平变化显著且与激素信号途径相关的基因。使用qRT-PCR方法检测这些基因在两种野生水稻中的相对转录量，为进一步研究水稻抗虫的分子机理和野生稻资源开发利用提供依据。

本发明的目的是提供引物用于检测经稻褐飞虱取食后野生稻体内激素信号相关基因转录水平的变化，本发明引物跨内含子设计，特异性高，可消除基因组扩增的影响，使用qRT-PCR技术进行野生稻体内激素信号相关基因的转录水平检测。

本发明所提供的的技术方案是：

一种检测野生稻响应稻褐飞虱取食的体内激素信号相关基因转录水平的方法，其特征在于：所述相关基因为基因ERF1(ethylene-responsive transcription factor 1)、GID1(gibberellin receptor)、DELLA(aspartic acid–glutamic acid–leucine–leucine–alanine)、PBS1(serine/threonine-protein kinase)、CALM(calmodulin)、TGA(transcription factor TGA)、BAS1(PHYB activation tagged suppressor 1)、或/和ARF(auxin response factor)，该方法是提取待测野生稻叶片总RNA，以所述相关基因的特异性引物对待测样品进行qRT-PCR检测，所述特异性引物如下：

进一步地，所述的检测方法，所述引物的用量及退火温度如下：