[发明专利]PD-1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。PD‑1敲除载体的构建，T淋巴细胞分离与激活，电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了制剂获得的速度。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD-1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。

背景技术

细胞免疫治疗中的CAR-T技术(T淋巴细胞采用基因工程方法改造而来)是目前疗效最显著的肿瘤细胞疗法，通过不断增加CAR元件的胞内信号分子数目已发展至第四代，与传统非特异性的DC细胞疗法等相比具备特异性强、疗效显著、副作用低的优点，在血液癌中疗效显著。但是细胞免疫治疗有其缺点存在，其根本原因是T淋巴细胞内的PD-1基因，PD-1(Programmed Death 1)程序性死亡受体-1：是一种重要的免疫抑制分子。癌细胞逃避免疫杀伤的一种机制，是通过它的表面产生一种称为程序性死亡配体-1(PD-L1)，当这种PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活。T细胞就不能够发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。

而目前相对成熟解决T细胞失活的方法是抗体技术。例如：2014年施贵宝公司研制的Opdivo(PD-1抑制剂Nivolumab)先后在日本和美国上市，而默沙东公司研制的Keytruda(PD-1抑制剂Pemboolizamab)则是第一个在美国上市的用于晚期转移皮肤黑色素瘤(Melanoma)的抑制剂，该PD-1抑制剂在这些皮肤黑色素瘤晚期转移病人的临床实验中，被发现持续性地抑制肿瘤，大大提高病人的存活时间和存活率(60％的病人存活超过两年)。

PD-1抗体药物治疗肿瘤疗效显著。然而目前国内尚无PD-1抗体，PD-1抗体治疗药物仍在研发之中，尚未进入临床试验。另外，PD-1抗体制备及纯化过程复杂，周期长，制造成本高，造成抗体药物昂贵，事实上普通百姓是难于承受这种高昂的治疗费用。

因此，采用CRISPR/Cas9技术敲除T淋巴细胞中的PD-1基因，从而激活T淋巴细胞对肿瘤细胞攻击的能力，实现肿瘤的免疫治疗。该方案细胞制备过程相对简单、周期短、成本低，更适合我国国情及普通百姓患者。目前，几乎所有的CAR-T疗法公司都和基因编辑公司开展合作，包括诺华、Juno和Cellectis在内的6家CAR-T疗法企业与IntelliaTherapeutics、Editas Medicine和CRISPR Therapeutics等基因编辑公司强强联合，开发结合基因编辑技术特别是CRISPR技术的CAR-T疗法。

发明内容

本发明的目的是提供一种PD-1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，简化了细胞的生产程序、提升了制剂获得的速度。

本发明所述的PD-1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，步骤如下：

(1)PD-1敲除载体的构建

根据PD-1全基因序列设计两个不同的gRNA target序列，然后将两个不同的gRNAtarget序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；

两个不同的gRNA target序列分别为5’-TGTGAGGAGTGGATAGGCCA-3’和5’-AGGGCCCGGCGCAATGACAG-3’；

(2)T淋巴细胞分离与激活

T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；

(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定

T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；

(4)流式细胞仪筛选与测序分析