[发明专利]一种碱性蛋白酶及其基因和应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种碱性蛋白酶及其基因和应用。本发明的碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的碱性蛋白酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了包含所述碱性蛋白酶基因的重组载体，以及包含所述碱性蛋白酶基因的重组菌株。本发明运用基因工程技术构建了含有碱性蛋白酶基因的重组质粒，并在解淀粉芽孢杆菌中实现了碱性蛋白酶的高效表达。构建的碱性蛋白酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产碱性蛋白酶的能力，在同等发酵条件下，较野生菌酶活提高了约55％。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及一种碱性蛋白酶及其基因和应用。

背景技术

碱性蛋白酶又被称为丝氨酸蛋白酶，属于蛋白酶类，其最适pH在9～11，在pH5～10时比较稳定。碱性蛋白酶主要用于洗涤工业，在食品、医疗、酿造、丝绸、制革等领域也有广泛的应用。

碱性蛋白酶最早发现于猪的胰脏中。1913年，Rohm首先将胰蛋白酶用于洗涤浸泡剂。1945年，瑞士的Dr.Jaag等发现微生物来源的碱性蛋白酶，使得蛋白酶广泛应用于洗涤剂工业成为可能。目前，蛋白酶是工业用酶中占比最大的酶类，约占全世界每年总销量的60％左右，其中碱性蛋白酶约占25％。因此碱性蛋白酶具有重大的商业价值与开发潜力。

相较于国外，虽然我国酶制剂工业快速发展，但是仍然存在一定差距。目前碱性蛋白酶市场需求量比较大，但是现有碱性蛋白酶生产菌株的生产水平有待提高，亟待研发出碱性蛋白酶的高效表达菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种碱性蛋白酶及其基因、工程菌(重组菌株)和制备方法。

本发明的另一目的提供上述碱性蛋白酶及基因工程菌的应用。

本发明从地衣芽孢杆菌CRVAB300(Bacillus licheniformis)中分离得到一种新的碱性蛋白酶。

本发明提供了一种碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明中的碱性蛋白酶，具有良好的热稳定性以及pH稳定性。其最适温度为40℃，在35～60℃之间相对酶活为80％以上。在40～50℃条件下保温1h，剩余酶活在70％以上，甚至在50℃保温2h后仍有60％的剩余酶活；重组碱性蛋白酶最适pH为10.5，在pH9～11之间相对酶活达到80％以上。其在pH7～11范围内耐受1h剩余酶活力达到90％以上。

本发明提供了编码上述碱性蛋白酶的基因。具体地，该基因的碱基序列如SEQ IDNO.2所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了所述碱性蛋白酶的编码基因，DNA全序列分析结果表明，碱性蛋白酶的编码基因全长1137bp。将碱性蛋白酶的编码基因经序列比对后发现与GENBANK ACCESSION Number为HM147766.1的碱性蛋白酶基因相似度达91％。

本发明还提供了包含上述碱性蛋白酶基因的重组载体，优选为包含权利要求2或3所述碱性蛋白酶基因的质粒pwB980。所述重组质粒pwB980还含有kan抗性基因、P43启动子序列、SPsacB信号肽序列、枯草芽孢杆菌终止子序列；本发明所述碱性蛋白酶基因位于重组质粒pwB980的SPsacB信号肽序列和枯草芽孢杆菌终止子序列之间。

本发明还提供了包含上述碱性蛋白酶基因的重组菌株，优选所述重组菌株为解淀粉芽孢杆菌K1。

本发明还提供了一种制备上述碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述包含本申请中上述碱性蛋白酶编码基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；