[发明专利]抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用

权利要求书

1.一种抑制甲型流感病毒A/Shanghai/N33(2008)/H1N1复制的shRNA序列，其特征在于，shRNA序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG。

2.一种用于制备权利要求1所述shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下：

上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；

下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’。

3.一种采用权利要求1所述shRNA序列制备的抑制甲型流感病毒A/Shanghai/N33(2008)/H1N1复制的质粒。

4.一种权利要求1所述shRNA序列在制备用于预防甲型流感病毒A/Shanghai/N33(2008)/H1N1感染药物中的用途，其特征在于：

根据human NP基因的转录本设计siRNA靶点，该靶点的序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG；

安排引物合成，所述引物序列如下：

上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；

下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’；

将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因；菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。

5.按照权利要求4所述用途，其特征在于，具体步骤如下：

1)、干扰靶点设计和引物合成：

根据shRNA设计的一般原则，设计siRNA靶点，安排引物合成；

2)、引物退火形成带粘性末端的双链片段：

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合；然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段；取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存；

3)、线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书；

4)、干扰片段连接入表达载体：

5)、感受态细胞的转化：

DH5α感受态细胞的转化；

6)、菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；

7)、阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，进行测序验证；用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析；

8)、质粒小提：

经测序验证正确的阳性克隆，命名为pLKD-NP-391，安排质粒小提，具体步骤见试剂盒说明书。