[发明专利]一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和农业领域，具体涉及一种茄子抗黄萎病细胞色素P450基因的获得方法及其应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)是我国重要蔬菜之一，营养丰富，经济效益较高，但大多数栽培茄易受黄萎病侵染。茄子黄萎病是由轮枝菌引起的一种土传性维管束病害，其症状通常表现为植株半边或叶片半边发黄、萎蔫，发病严重时劈开茎秆，可见维管束变褐。该病潜伏期长，传播能力强，为害范围广。发病严重时产量损失可达60％以上，美国、日本和印度都曾爆发茄子黄萎病，造成大面积减产。针对茄子黄萎病的防治，目前生产中多采用化学药剂、轮作等方法，但由于农药污染、经济成本等方面的矛盾，这些防治方法的实际应用效果不佳。

P450基因(细胞色素P450家族基因)在植物防御反应中发挥了非常重要的作用，广泛参与植保素的合成、激素代谢及大量次生代谢物的合成过程。如拟南芥植保素的生物合成涉及5个P450酶：CYP79B2、CYP79B3、CYP71A12、CYP71A13和CYP71B15。此外，拟南芥P450家族中12个基因特异受到A.brassicicola(芸薹链格孢)的诱导表达，5个受到A.alternata(链格孢)的诱导表达。拟南芥中超量表达CaCYP450A还能增强对假单胞杆菌(Pst)和活体营养型卵菌的抗性。以上研究表明大量P450基因参与拟南芥的生物胁迫反应。P450参与植物抗黄萎病反应的研究也逐渐受到关注，棉花中黄萎病菌会诱导棉酚的大量合成，Luo等人发现黄萎病菌侵染后棉花中CYP706B1参与了棉酚的合成，推测CYP706B1可能在棉花抗黄萎病反应中发挥了一定的作用。Sun等从棉花中发现了一个P450家族新成员SSN(Silence-Induced Stem Necrosis)基因，SSN基因表达被抑制后转基因棉花茎杆产生类病斑。进一步研究发现，SSN表达被抑制后转基因棉花根中茉莉酸的合成和信号路径组成型激活。SSN基因在棉花中超量表达和抑制表达后极显著影响了转基因植株根部的脂类代谢。脂类代谢异常使游离脂类成分或其衍生物作为系统信号激活了棉花地上部分的组成型免疫反应并产生细胞坏死。表明SSN在棉花基础免疫反应调控中起到一个开关的作用，通过调控脂类代谢影响棉花应对病原菌侵染后的抗性水平。该发现是迄今棉花抗黄萎病研究中取得的最重要的成果之一。此外，Prall等研究还发现CYP72A基因在茄科作物中变异程度最大，推测驯化过程中CYP72A基因的丢失可能也与野生种和栽培种的抗性差异有关。其他植物中，P450参与抗病反应的报道，如PepCYP调控辣椒炭疽病，CYP82C2参与葡萄灰霉病调控等，以上研究表明大量P450家族基因参与了植物抗病反应，并且P450家族基因调控植物黄萎病的研究也正逐渐受到关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茄子抗黄萎病细胞色素P450基因的获得方法及其应用。本发明的发明理念为：充分利用分子育种的优势，从分子生物学方法的角度出发，利用RACE方法扩增、并对RACE产物测序、拼接，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长；随后，对其进行生物信息学分析、测定黄萎病菌接种后该基因的表达量变化，同时检测过氧化物酶活性以进一步验证其功能，揭示该基因在黄萎病抗性中所发挥的作用，确定抗黄萎病基因。

本发明提供了一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A，具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该基因是茄子抗黄蒌病相关基因，是一条长度为2035bp的cDNA序列。该基因5’UTR含129bp，3’UTR含331bp。CDS全长1575bp,编码524个氨基酸。

本发明还公开了该基因编码一种茄子抗黄萎病相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的氨基酸序列含有细胞色素氧化酶典型的保守结构域。

本发明还提供了一种茄子细胞色素P450基因的获得方法，包括以下步骤：

1)提取水茄样本总RNA；

2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，进行RACE-PCR扩增，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长，在RACE-PCR扩增中所使用的特异引物的核苷酸序列如下：

R1F：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’(SEQ ID NO.3)

R1R：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’；(SEQ ID NO.4)

3)对步骤2)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。

上述方法步骤1)中，推荐使用水茄样本四片真叶时期的根为材料提取总RNA。