[发明专利]检测核酸差异的探针形式

权利要求书

1.包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测生物学样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法，所述方法包括：

a. 使所述包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针与所述样品接触；和

b. 检测所述探针与所述靶核酸的结合的存在或不存在，

其中所述锚定物结构域和报道物结构域小于50%互补并通过非核苷接头连接，所述非核苷接头是六甘醇，并且所述锚定物结构域或报道物结构域在不存在所述靶核酸的情况下都不形成茎环；

和其中

（i）所述探针是不可通过聚合酶延伸的；

（ii）所述接头在所述锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与所述锚定物结构域连接，并且所述接头在所述报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与所述报道物结构域连接，其中所述锚定物结构域不与可检测标记连接，并且所述报道物结构域包含一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能靶序列之间的解链温度中的差异得到强调，其中所述报道物结构域长度为9个核苷酸且包含5个稳定碱基，并且在对应于模板中的可变区的报道物结构域中心无稳定碱基，从而使得所述探针可以用于区分在不同位置的错配；

（iii）所述锚定物结构域和所述报道物结构域各自包含与所述靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列；和

（iv）在所述锚定物结构域和所述靶核酸之间的杂交本身足以驱动所述探针在所述靶核酸的预期位置上的杂交。

2.权利要求1的用途，其中所述检测步骤包括测量在所述报道物结构域和所述靶核酸之间形成的复合物的解链温度。

3.权利要求1的用途，其中所述标记是荧光标记，并且进一步包括使所述探针和样品与可溶性嵌入猝灭剂接触，从而使得当所述报道物结构域与所述靶核酸形成复合物时，所述猝灭剂改变来自所述标记的荧光。

4.权利要求1的用途，其中所述靶核酸是包含单核苷酸多态性（SNP）的人核酸，并且所述报道物结构域与所述SNP的一个等位基因100％互补。

5.权利要求1的用途，其中所述探针包含至少一个非天然核苷酸，其中与代替所述非天然核苷酸的相应天然核苷酸比较，所述非天然核苷酸增加所述报道物结构域的解链温度。

6.一种用于检测靶序列的存在或不存在的反应混合物，其包含：

a. 包含锚定物结合区和报道物结合区的靶核酸，和

b. 包含锚定物核酸结构域和报道物核酸结构域的可检测标记的探针，

其中所述锚定物结构域和报道物结构域小于50%互补并通过非核苷接头连接，所述非核苷接头是六甘醇，并且所述锚定物结构域或报道物结构域在不存在所述靶核酸的情况下都不形成茎环；和

其中

（i）所述探针是不可通过聚合酶延伸的；

（ii）所述接头在所述锚定物结构域的3'末端的2个核苷酸内与所述锚定物结构域连接，并且所述接头在所述报道物结构域的5'末端的2个核苷酸内与所述报道物结构域连接，其中所述锚定物结构域不与可检测标记连接，并且所述报道物结构域包含一个或多个稳定碱基，从而使得在报道物结构域和可能靶序列之间的解链温度中的差异得到强调，其中所述报道物结构域长度为9个核苷酸且包含5个稳定碱基，并且在对应于模板中的可变区的报道物结构域中心无稳定碱基，从而使得所述探针可以用于区分在不同位置的错配；

（iii）所述锚定物结构域和所述报道物结构域各自包含与所述靶核酸的相同链互补的至少6个核苷酸的邻接序列；和

（iv）在所述锚定物结构域和所述靶核酸之间的杂交本身足以驱动所述探针在所述靶核酸的预期位置上的杂交。

7.权利要求6的反应混合物，其中所述标记是荧光标记，并且进一步包括可溶性嵌入猝灭剂，其中当所述报道物结构域与所述靶核酸形成复合物时，所述猝灭剂改变来自所述标记的荧光。

8.权利要求6的反应混合物，其中所述靶核酸是包含单核苷酸多态性（SNP）的人核酸，并且所述报道物结构域与所述SNP的一个等位基因100％互补。