[发明专利]一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和用于验证miRNA是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。从本世纪初，科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNA中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNA表达模式具有分化的位相性和时序性，由于miRNA存在的广泛性和多样性，提示miRNA可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNA在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNA可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。然而，大多数miRNA的靶基因及功能仍旧未知。因此，明确miRNA的靶基因并验证其参与调控基因表达的分子基础具有重要意义。

采用荧光表达系统定量基因表达时，通常使用第二个报告基因作为内参来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因比如氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)不够便利，因为各自的测试处理要求、检测特点存在差异。近年使用较多的萤火虫荧光素酶避免了上述缺点，但是由于荧光素酶底物价格昂贵，需使用特殊仪器检测荧光素酶表达等因素限制了其使用范围。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的一个目的在于，提供一种含有双报告基因的重组质粒载体及其构建方法，本发明的另一个目的在于，将构建的含有双报告基因的重组质粒载体用于验证miRNA及其靶基因之间的关系，以便实现miRNA与靶序列的快速检测。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列。

根据本发明，所述编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因在双向的转录响应原件启动子(Transcriptional response element，TRE)的控制下表达。

所述编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列以及miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列被放置在两个表达读码框内，所述编码的绿色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、绿色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第一polyA加尾信号；所述编码的红色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、红色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第二polyA加尾信号。

进一步地，所述的双向转录响应原件启动子的激活受强力霉素的调控。

上述双荧光报告重组质粒载体的构建方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：

(1)用PCR方法扩增绿色荧光蛋白基因；

(2)将步骤(1)扩增的绿色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G-BI启动子的3’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G-GFP，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；

(3)用PCR方法扩增红色荧光蛋白基因；

(4)将步骤(3)扩增的红色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G-GFP启动子的5’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；

(5)用PCR方法扩增miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列插入到质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry的mCherry 3’方向上，将验证正确后的重组质粒载体命名为pTRE3G-GFP-mCherry-3UTR。

根据申请人的实验表明，上述双荧光报告重组质粒载体可以用于验证miRNA是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。