[发明专利]一种利用大花六道木叶片进行离体再生的方法

权利要求书

1.一种利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，包括以下步骤：

1)外植体预处理

选取大花六道木叶片作为外植体，外植体清洗后进行消毒，再冲洗，备用；

2)诱导不定芽

将叶片剪切后接种于诱导培养基中，暗培养30～40天，诱导出不定芽；

其中，所述的诱导培养基以改良MS培养基为基本培养基，并添加了6-苄基腺嘌呤0.4～0.6mg/L；其中，所述改良MS培养基为NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O和KH₂PO₄含量减少的MS培养基；

3)增殖培养

将不定芽转入增殖培养基中，光照培养20～30天，形成丛生芽；

光照培养条件为：温度25～28℃，光照时间14～16小时，光照强度为2000～3000勒克斯；

其中，所述的增殖培养基以WPM培养基为基本培养基，并添加了6-苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/L、添加活性炭0.4～0.8g/L和萘乙酸0.1～0.2mg/L；

4)生根培养

将丛生芽切分成单株，接入生根培养基中，培养25～30天后生根，得到生根苗；

培养条件为：温度25～28℃，光照时间14～16小时，光照强度为2000～3000勒克斯；

其中，所述的生根培养基以WPM培养基为基本培养基，并添加了吲哚丁酸0.2～1mg/L、活性炭0.4～0.8g/L、抗坏血酸0.2～0.4g/L和萘乙酸0.5～1.0mg/L；

5)炼苗、驯化

将大花六道木生根苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗2～3天，

移栽至基质中，保持温度20～30℃，驯化培养20～30天，得到幼苗。

2.根据权利要求1所述利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，其特征在于，步骤2)所述的暗培养温度为25～28℃。

3.根据权利要求1所述利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，其特征在于，步骤2)～4)中所述的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中分别添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，培养基pH值为5.75～5.85。

4.根据权利要求1所述利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，其特征在于，步骤5)中所述基质为：草炭土：珍珠岩＝3～4：1，体积比。

5.根据权利要求1～4任一项所述利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，其特征在于，所述改良MS培养基中，NH₄NO₃含量为800～850mg/L，KNO₃含量为900～1000mg/L，CaCl₂·2H₂O含量为200～240mg/L，MgSO₄·7H₂O含量为170～200mg/L，KH₂PO₄含量为80～90mg/L。

6.根据权利要求1～4任一项所述利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，其特征在于，所述改良MS培养基中，NH₄NO₃含量为825mg/L，KNO₃含量为950mg/L，CaCl₂·2H₂O含量为220mg/L，MgSO₄·7H₂O含量为185mg/L，KH₂PO₄含量为85mg/L。