[发明专利]用于原位检测核酸的超灵敏方法

说明书

本申请是申请日为2011年10月21日，申请号为201180062037.1，发明名称为“用于原位检测核酸的超灵敏方法”的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请的引用

本申请要求于2010年10月21日提交的代理人卷号no.12790-021-888的标题为“用于原位检测核酸的超灵敏方法(ULTRA SENSITIVE METHOD FOR IN SITU DETECTION OF NUCLEIC ACIDS)”的美国临时专利申请第61/405,503号(Wu等人)和2010年11月10日提交的代理人卷号no.12790-022-888的标题为“用于原位检测核酸的超灵敏方法(ULTRA SENSITIVE METHOD FOR IN SITU DETECTION OF NUCLEIC ACIDS)”的美国临时专利申请第61/412,276号(Wu等人)的优先权和权益。这些申请中的每一个均出于各种目的以其全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及核酸化学和生物化学测定。更具体地，本发明涉及用于原位检测样品中核酸分析物的方法。

背景技术

原位杂交(ISH)是一种允许检测和定位保存形态的单个细胞、组织学组织切片或染色体制备中的特定核酸分子的技术。在1969年首次描述了这种技术，并且该技术基于核苷酸探针与细胞中DNA或RNA的特异性目标序列的互补杂交。其可以是内源DNA、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、病毒序列或细菌序列。用报告分子标记所加入的探针，并且通过荧光(荧光原位杂交，FISH)或显色(显色原位杂交，CISH)使结合位点可见。

在人类全基因组测序完成后，近年来在公共数据库和非公共数据库中已注释了成千上万个新的人基因序列。由于它相对容易、快速并且廉价地设计并合成了用于检测细胞中任何新基因的特定序列的反义探针，因此这为ISH打开了新的大门。通过ISH可以获得基因的组织特异性和细胞类型特异性表达模式以及表达水平，这将为分析基因功能提供有价值的信息。

然而，由于ISH技术的灵敏度和特异性较差而不能检测细胞中低拷贝数的DNA或RNA靶标，这会限制它们的应用。将ISH应用于临床标准是特别困难的，其中使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来保存临床组织样品是世界上最常使用的方法。FFPE法良好地保存了组织形态，但是通过甲醛的交联固定会导致目标序列与检测探针的可接近性较差，探针分子与其他分子或结构之间的化学或物理相互作用较差，以及对核酸(尤其是mRNA)的损伤。

为了克服ISH的限制并扩展它在诊断病理学中的应用，已开发了几种策略以改善ISH的灵敏度。最近，Advanced Cell Diagnostics,Inc.开发出了称为的新型ISH信号放大方法(美国专利第7,709,198号)。这种测定包括独特设计的低聚捕获探针以及由预扩增子(preamplifier)、扩增子(amplifier)和标记探针组成的信号放大系统，从而使得能够在不放大背景信号的情况下显著放大信号，并能够对几乎任何基因进行单个RNA分子检测。在图1中示意地说明了技术的示例性实施方式并且将在本申请的第二部分中详细说明。

在用于检测目标核酸的典型测定中，待检测其表达的目标mRNA从细胞中释放并被到固体表面(例如，微量滴定板的孔)上。还提供了一组两个或更多个捕获探针和信号产生多聚体。所述捕获探针与目标核酸和信号产生多聚体两者杂交，并因此将信号产生多聚体捕获至目标核酸。所述信号产生多聚体包含标记探针(LP)。但是更通常地，除标记探针外，所述信号产生多聚体包含预扩增子和/或扩增子。所述标记探针能够结合至提供可检测信号的标记颗粒或分子。标记探针具有使得能够连接多个标记颗粒或分子的较大分子结构，其提供了比单个标记颗粒或分子更强的信号。因此，改善了核酸检测的灵敏度和特异性。

然而，单独利用仍不能可靠地检测以往的其中RNA被显著降解的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织切片中的一些低拷贝基因。另外，使用当前的技术不能使单个RNA分子以40×放大显象。期望进一步增强检测信号以使得能够更稳健地检测任何RNA分子，包括显著降解的RNA分子，并允许对所检测的RNA信号以10×放大容易地显像。