[发明专利]一种应用于软骨损伤修复的复合材料

权利要求书

1.一种应用于软骨损伤修复的复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)细胞外基质复合材料的制备：

①细胞外基质浆料的制备：

A、取得胎盘，在无菌条件下剥离胎盘上羊膜和下基膜及明显血管，余下的组织用无菌三蒸水冲洗直至无血液成分流出后，用双氧水浸泡后，加入无菌三蒸水，在低温下用搅碎机粉碎成细胞外胶质匀浆；

B、取步骤A得到的匀浆，在匀浆中加入10倍体积的三蒸水混匀，冷冻后于常温融化，反复3～4次冻融，使残余细胞破碎；然后将匀浆离心，取上清加入聚乙二醇辛基苯基醚、胰蛋白酶、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，于4℃条件下搅拌，洗脱后离心取上清液待用；

C、取步骤B的上清液用DNA消化酶和RNA消化酶混合液于37℃消化后离心，再用无菌三蒸水洗去细胞碎片和残留物质，然后调至pH 7.0后取上层匀浆进行离心，收集沉淀即为细胞外基质浆料；

②细胞外基质与软骨生成蛋白组合成复合材料的制备：

D、取步骤①得到的细胞外基质浆料，加入三蒸水调为混悬液，充分搅拌均匀待用；

E、取软骨生成蛋白加入步骤D待用的混悬液，充分混匀后注入模具中，预冻后放入冷冻干燥机中进行冻干，形成三维多孔海绵支架；

F、将步骤E得到的支架置于紫外线照射下进行交联，然后再放入含N-羟基琥珀酰亚胺和乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺的乙醇溶液中交联，再无菌条件下用磷酸缓冲液(PBS)漂洗浸泡，最后用三蒸水漂洗去除残余交联剂，经冻干后密封保存备用；

(2)人源性脐带间充质干细胞的制备：

①选取人源性脐带组织和胎盘组织，在无菌条件下剥离胎盘上羊膜和下基膜及明显血管，余下的组织用无菌三蒸水反复冲洗直至无血液成分流出后，用双氧水浸泡后剪成片状并在F12培养基中进行贴壁培养；

②观察到人源性脐带间充质干细胞生长后，使用胰酶-EDTA消化贴壁培养皿15-30S，用培养基中止消化后离心，取沉淀细胞在6个康宁75cm矩形培养瓶中，再加入无血清培养基DEME/F-12孵育细胞继续培养到培养瓶80％面积时，用胰酶消化所有间充质干细胞，离心后用冻存液封存于外旋冻存管中待用；

(3)使用前一日，将步骤(2)冷存的人源性脐带间充质干细胞解冻，按照数量为1×10⁶ 的人源性脐带间充质干细胞负载在10g支架材料上的比例，将人源性脐带间充质干细胞加入康宁培养皿中的三维多孔海绵支架上，再用二氧化碳培养箱培养，负载2小时以上就可用注射治疗。