[发明专利]一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统及采用该系统的动态成像方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统和方法，具体是利用位移台控制机制实现倒置显微镜下光学超分辨率显微观测成像，并可以实现宏、微、纳无缝观测，以及具有实时视觉反馈的纳米操作。主要用于需要纳米级超分辨率实时动态观测和操作领域，包括材料、生命科学等各个领域。

背景技术

19世纪末，德国科学家恩斯特·阿贝定义了光学显微镜的分辨率，认为是光波长的一半，即：约为0.2微米，这就是著名的光学衍射极限。因此，在二十世纪的大部分时间里，科学家们都相信光学显微镜永远无法突破衍射极限的限制。然而，随着科学研究的深入，尤其是生物科学领域的研究，人们早已开始研究细胞的内部结构，因此需要对细胞内部的组织结构进行活体观测。电子显微镜只能观测死亡细胞的表面，无法观测活体细胞的内部结构。近些年来发展起来的利用荧光探针的超分辨荧光显微技术，包括：受激发射损耗显微镜超分辨成像(STED)、饱和结构照明显微技术(SSIM)、以及随机光学显微重构技术 (STORM)和光激活定位显微技术(PALM)，虽然革命性地突破了光学衍射极限的限制，然而他们成像费时并受限于荧光探针，因而不能提供面向全貌和实时的超分辨光学成像。例如：所述的STED是串行扫描工作模式，逐点扫描成像效率低；所述的STORM是以时间换取空间分辨率，成一幅图像近场需要处理成千上万张照片所需时间在十分钟以上。这些方法对荧光染剂具有很强的依赖性，成像前需要对样品进行荧光染色。样品需要特殊荧光染剂，只适用于某些生物样本成像。基于微球透镜的超分辨率的光学成像的技术研究成果最早发表于2009年Nature杂志(www.nature.com/doifinder/10.1038/nature08173)，当时的分辨率为220nm，两年后，这个分辨率被提高到了50nm(Nature Communication, DOI:10.1038/ncomms1211)。不同于荧光显微镜的是，基于隐失波的纳米成像不需荧光染剂，而且是自然光照条件，因而更具有广泛应用的意义，适合任何样本成像。

到目前为止，基于微球透镜的超分辨率成像只能在正置显微镜上实现而不能在倒置显微镜上实现，原因在于由倏逝波被吸收后转化的传播波的传播方向是从样品向微球方向传播。在正置显微镜下，这些转化的传播波正好被物镜采集后成像；而在倒置显微镜下，这些转化的传播波远离显微镜的物镜，因此无法被物镜采集并成像。而倒置显微镜广泛用于观测生物细胞内部结构组织，它是生物学研究细胞功能的重要仪器。同时倒置金相显微镜也是鉴定和分析金属内部结构组织，和金属学研究金相的重要仪器，是工业部门鉴定产品质量的关键设备，该仪器配用摄像装置，可摄取金相图谱，并对图谱进行测量分析，对图像进行编辑、输出、存储、管理等功能。如果能在倒置显微镜下实现光学超分辨率成像，其意义将非常重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种可在倒置显微镜下实现光学超分辨率成像的基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统，包括：光学反光镜1、微球透镜2、原子力显微镜扫描探针3、样品台5、光学倒置显微镜6和位移台7，原子力显微镜扫描探针3通过其基底30粘贴在光学反光镜1上，所述的微球透镜2固定在所述原子力显微镜扫描探针3的悬臂梁31和针尖32上，并且，微球透镜2位于光学反光镜1的下方，光学反光镜1固定在位于其上方的位移台7上；所述的样品台5位于微球透镜2的下方，所述的光学倒置显微镜6位于所述样品台5的下方，并且，光学倒置显微镜6的物镜位于所述的微球透镜2的正下方。

作为一种优选方案，在所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率成像系统中，所述微球透镜2的尺寸直径在20～100微米之间。

作为一种优选方案，在所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率成像系统中，所述的微球透镜2设置于所述原子力显微镜探针3的悬臂梁 31的末端。

作为一种优选方案，在所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率成像系统中，所述微球透镜2的最底端位置与样品4表面的距离小于1微米。

作为一种优选方案，在所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率成像系统中，所述的光学倒置显微镜6的物镜放大倍数大于等于20倍。