[发明专利]一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ及其制备方法在审
| 申请号： | 201710670285.3 | 申请日： | 2017-08-08 |
| 公开（公告）号： | CN109385389A | 公开（公告）日： | 2019-02-26 |
| 发明（设计）人： | 黄艳娜;游春苹;刘振民 | 申请（专利权）人： | 光明乳业股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/74 |
| 代理公司： | 北京东正专利代理事务所(普通合伙) 11312 | 代理人： | 张亦华 |
| 地址： | 201103 *** | 国省代码： | 上海;31 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 植物乳杆菌 乳酸 合成 制备 乳酸菌 发酵性能 改良植物 人体吸收 同源重组 研究对象 遗传改造 遗传性能 乳杆菌 构建 菌株 改良 | ||
1.一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ，其特征在于，植物乳杆菌ST-Ⅲ中的ldhA基因上游基因片段被敲除质粒携带的ldhA基因上游同源臂基因替换，植物乳杆菌ST-Ⅲ中的ldhA基因下游基因片段被敲除质粒携带的ldhA基因下游同源臂基因替换，ldhA基因上游同源臂基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO:1、ldhA基因下游同源臂基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求1所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ，其特征在于，敲除质粒包括质粒pNZ5319、ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因，质粒pNZ5319同时连接ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因。
3.一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、以植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组DNA为模板，分别PCR扩增ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因；
S2、用限制性内切酶同时酶切质粒pNZ5319和S1步骤中PCR扩增后的ldhA基因上游同源臂基因，并将酶切后获得的产物在连接酶的作用下进行重新连接，得到包含上游同源臂的重组质粒；
S3、用限制性内切酶同时酶切S2步骤中的重组质粒和S1步骤中PCR扩增后的ldhA基因下游同源臂基因，酶切后获得的产物在连接酶的作用下重新进行连接，连接后得到包含上下游同源臂的重组质粒即为敲除质粒；
S4、将S3步骤中的敲除质粒电转化至植物乳杆菌ST-Ⅲ感受态细胞中；
S5、对转化后获得的植物乳杆菌ST-Ⅲ进行抗性验证。
4.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的PCR扩增体系中以植物乳杆菌ST-Ⅲ为模板设计引物对，该引物对分别为ldhA基因上游同源臂引物对和ldhA基因下游同源臂引物对，ldhA基因上游同源臂引物对的碱基序列为序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，ldhA基因下游同源臂引物对的碱基序列为序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
5.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S1还包括对PCR扩增后的ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因分别进行测序验证。
6.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S2中的用限制性内切酶做酶切处理是用PmeI、XhoI同时进行双酶切处理，步骤S3中的用限制性内切酶做酶切处理是用Ecl136Ⅱ、BglⅡ同时进行双酶切处理。
7.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S3还包括对所得到的敲除质粒进行电泳检测。
8.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S4中将敲除质粒电转化至植物乳杆菌ST-Ⅲ感受态细胞中，电转化参数为：电压2.0-2.5kv,电击时间3-7ms。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于光明乳业股份有限公司，未经光明乳业股份有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201710670285.3/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
