[发明专利]一种植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶、其编码基因及应用

说明书

本发明涉及一种植物乳杆菌D‑乳酸脱氢酶、其编码基因及应用。本发明的植物乳杆菌D‑乳酸脱氢酶氨基酸序列为：SEQ ID NO：2。所述D‑乳酸脱氢酶可高效的催化苯丙酮酸生产苯乳酸，还可以作用于丙酮酸等其它酮类化合物，生产的酶制剂可用于食品加工、医药和化工等行业。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶基因、含有该基因的工程菌及其应用。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，也称3-苯基乳酸或β-苯乳酸，即2-羟基-3-苯基丙酸，是近年来发现的新型天然防腐剂。苯乳酸抑菌谱宽，不仅能够抑制多种食源性致病菌，而且对引起食品腐败的真菌具有广泛的作用。此外，苯乳酸安全无毒，有望开发成一种新型生物防腐剂应用于食品工业。它的溶解性好，易于在食品体系中扩散；稳定性高，具有宽广的pH范围和热稳定性，在食品工业中具有广阔的应用前景，可应用于医药与化妆品行业。苯乳酸具有D-苯基乳酸和L-苯基乳酸两种构型，研究表明，D-苯乳酸的抑菌能力高于L-苯乳酸。

微生物是各种酶的重要来源。通过从环境中筛选分离产酶微生物，利用分子克隆技术从产酶微生物中克隆产酶基因，再将其与合适的载体连接并转入相应宿主细胞，可进行酶的大量表达。目前，通过基因工程技术手段进行生产酶，已经成为工业用酶的主导。

乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenae，LDH)广泛存在于多种生物体内，在高等动物体内只有L-乳酸脱氢酶，而在很多细菌内包括乳酸菌内(例如植物乳杆菌)有两种乳酸脱氢酶，D-乳酸脱氢酶(D-LDH，EC：1.1.1.28)和L-乳酸脱氢酶(L-LDH，EC：1.1.1.27)。这两种酶能分别催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸与L-苯乳酸。

发明内容

本发明的目的是针对植物乳杆菌乳酸脱氢酶在微生物体内的表达受到严格调控而致使胞内乳酸脱氢酶含量较低，限制了苯乳酸产量的问题，提供一种植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶。

本发明的另一目的是提供编码该植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的基因、含有该基因的重组质粒和基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的应用。利用基因工程技术获得高效表达乳酸脱氢酶的工程菌从而提高苯基乳酸产量，开拓苯乳酸在食品与药品行业的应用前景。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

编码所述植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为999bp，G+C含量为42.14％，编码332个氨基酸。

一种重组质粒，该重组质粒是含有上述的植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因，其载体选用pET-28a(+)质粒。

一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述的植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因。

所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用pET-28a(+)质粒连接植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因，构建重组质粒；

(2将重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌；

(3)将所获得的重组菌转接到含有50mg/L卡那霉素的平板上，37℃培养12h后，挑取单菌落进行菌落pcr，以及双酶切验证，最后经测序验证基因序列无误后，保存。