[发明专利]闭管可视化鳗源嗜水气单胞菌环介导等温扩增检测方法

说明书

闭管可视化鳗源嗜水气单胞菌环介导等温扩增检测方法，涉及水生动物病原微生物检测。鳗鲡基因组提取；提取致病菌基因组；制备阳性对照；阴性对照制备；样品检测及结果判定。分别以嗜水气单胞菌管家基因gyrB和致病因子hlyA保守序列，设计了LAMP引物，建立LAMP反应体系，并通过在LAMP反应中添加不同的pH指示剂，以达到闭管可视化判定靶基因是否被有效扩增的效果。采用闭管可视化快速检测鳗源致病性嗜水气单胞菌的方法，因为反应产物无须通过电泳和/或开管添加入荧光染料等鉴定，因此降低了LAMP产物的污染风险。

技术领域

本发明涉及水生动物病原微生物检测，尤其是涉及一种基于环介导恒温扩增技术的快速闭管可视化式、检测鳗鲡致病性嗜水气单胞菌气单胞菌的方法。

背景技术

鳗鲡(Anguilla spp.)是世界名贵经济鱼类，鳗鲡养殖在我国已有近30年的历史，养殖产量约占全球的70％，是我国出口创汇的重要产业之一。然而，在集约化高密度养殖过程中，鳗鲡细菌性疾病的爆发，严重制约了中国鳗鲡养殖业的健康可持续性发展(熊静等.2017.7株鳗鲡致病性气单胞菌毒力基因胞外产物及其活性比较,华中农业大学学报,2017,36(1):76-85)。嗜水气单胞菌(Aermonas hydrophila)是一类条件致病菌，广泛存在于水和土壤中，是我国养鱼史上引发危害面积最大、损失最为严重的细菌性败血症的主要病原之一。该菌感染鳗鲡后导致鱼体表出血、水肿、腹部膨胀及肾脏变黑等临床症状，从而引发鱼类败血症，造成大量死亡。国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止细菌传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的嗜水气单胞菌检测方法是减少嗜水气单胞菌的发生和危害的重要途径。传统嗜水气单胞菌检测主要是常规生化鉴定方法，由于气单胞菌属的种类繁多，而且它们的生化性状极为相似，需要采取一系列生化鉴定反应才能够鉴定到种，存在着操作繁琐、检测周期长、鉴定结果不准确等缺点，远不能满足日常快速检测工作的需要。以酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assays，ELISA)为代表的免疫学技术虽比传统鉴定方法简单、快速，但前提是必需先制备相关抗体，同时由于该方法操作步骤繁琐、影响因素较多，极易导致较高的假阳性率。以PCR技术为代表的分子生物学技术已成功应用于嗜水气单胞菌的实验室诊断，具有灵敏度高的优点，但需要依赖昂贵的热循环系统，难以在基层中普及。由日本学者Notomi等提出的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)在保留原有分子生物学技术特异性强、灵敏度高等优点的基础上(Notomi et al.2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,28(12):E63)，实现了恒定温度下对靶基因的高效扩增，脱离了对PCR仪等专业设备的依赖，更加适用于病原的临床检测。