[发明专利]一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球

权利要求书

1.一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：由抗CpTI蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小200nm，表面载基团为羧基；

检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球是由下述方法制备的，制备的具体步骤如下：

1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长CpTI基因表达序列；

2)构建细菌融合表达载体pGEX-4T-2-CpTI，将CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体中；

所述构建融合表达载体体pGEX-4T-2-CpTI是pGEX-4T-2-CpTI3；

3)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白；

所述亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B；

4)将佐剂溶合抗原后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CpTI多克隆抗体；

5)将步骤4)所得鼠抗CpTI多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测CpTI蛋白的人工微球；

所述偶联活化微球是首先用活化剂碳化二亚胺活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体。

2.根据权利要求1所述的一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：步骤1)构建全长CpTI基因表达序列的具体步骤如下：

①设计全长CpTI基因序列；

②根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰，采用全基因合成技术构建全长CpTI基因，共333对碱基，克隆至载体pGEM-T Easy；

③通过菌落PCR验证CpTI基因片断插入的正确性；

④将克隆CpTI基因菌实施扩增培养，提取质粒后进行酶切和琼脂糖电泳分析；

⑤DNA测序，保证基因的全部序列100％准确。

3.根据权利要求1所述的一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：步骤2)所述谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体是pGEX-4T-2，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-2-CpTI3对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：步骤2)对表达载体进行细菌表达的步骤是：

①将融合表达载体pGEX-4T-2-CpTI转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，细胞生长条件为230转/分，温度37℃；

②当菌体生长OD₅₉₅值为0.5-0.8时，加入1.0mM的诱导剂IPTG，在25℃诱导3小时；在4℃时，以5,000×g离心5分钟，收集菌体；

③菌体经PBS缓冲液清洗3次后，超声破碎，破碎细胞在4℃时，以14,000×g离心1小时，收集上清液。

5.根据权利要求1所述的一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：步骤3)中将步骤2)收集的上清液循环通过Glutathione Sepharose 4B亲合层析柱，4℃过夜，未结合蛋白用10倍床体积的1×PBS冲洗；结合的GST-CpTI融合蛋白用洗脱液洗脱并收集、保存。

6.根据权利要求1所述的一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：步骤4)的具体步骤是：

①将GST-CpTI融合蛋白抗原与弗氏佐剂混合后，充分乳化，采用背部多点注射法BALB/c小鼠；每次的抗原量约10μg，三次，每次两周后经尾动脉取血检测抗体效价；

②以适宜浓度的抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；

③用0.1M，pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤后，加入待检的血清样品，100μl/孔，37℃1小时；设阴性对照孔；

④用0.1M，pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100μl/孔，37℃避光显色15分钟；用2M H₂SO₄终止反应后，阅读各孔的A490值；。

⑤对制备的抗GST-CpTI融合蛋白抗体，经ELISA法检测，抗体能与GST-CpTI，GST蛋白特异性结合，测特异性结合相关系数。

7.根据权利要求1所述的一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球，其特征在于：步骤5)通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球的制备和检测步骤如下：

①将单分散羧基化聚苯乙烯微球用活化剂碳化二亚胺活化，然后加入保护剂Sulfo-NHS，使检测CpTI蛋白的人工微球形成稳定的活泼酯中间体；

②在活泼酯中间体中加入抗CpTI蛋白多克隆抗体，温育1-2小时；

③用0.1M，pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤后，收集检测CpTI蛋白的人工微球；

④通过CA-1680型生化分析仪，采用人工增强比浊法，检测CpTI融合蛋白样品；

⑤经生化分析仪检测，用于检测CpTI蛋白的人工微球最低检测限为CpTI融合蛋白0.2μg/ml，其相关系数R²＝0.67。