[发明专利]一种人凝血因子Ⅷ的制备方法

说明书

本发明公开了一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，在人凝血因子Ⅷ制备过程中，对人血浆初料处理时采用二步压滤法，即在冷沉淀溶解之后；采用K700滤板进行压滤；收集压滤液；调整pH值，加入2%氢氧化铝凝胶吸附；再EK滤板进行压滤，采用二步压滤法提高分离效果，同时结合氢氧化铝凝胶吸附法去除维生素K依赖的凝血因子，氢氧化铝凝胶不吸附人凝血因子Ⅷ，产品收得率高。本发明在制备过程中采用二步压滤法替代传统的二步高速离心法，及采用CUNO DELP深层滤芯过滤，两步梯度透析法，冻干工艺增加了复溶复冻工艺等，同时，生产过程采用多种病毒去除/灭活技术，可提高产品的收得率，可减少传播病毒的风险，提高临床用药的安全性。

技术领域

本发明涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，属于生物制药领域。

背景技术

甲型血友病(HA)为最常见的遗传性出血性疾病，系由血浆中凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺失所致。FⅧ基因位于X染色体，所以患者绝大多数为男性，女性杂合子为携带者，而女性患者极少见。重型患者自幼即有反复自发性出血，不经治疗者往往造成关节畸形和致残，严重者可因颅内出血死亡。目前仍以替代疗法为主，如全血、冷沉淀、人凝血因子Ⅷ制剂等，由于全血和冷沉淀纯度低、输注量大、副反应多、存在传播血液病毒的风险等，临床全血或冷沉淀替代疗法已少用，多用人凝血因子Ⅷ制剂替代疗法。

人凝血因子Ⅷ亦称抗血友病球蛋白，是一种血浆糖蛋白，在凝血机制中的内部途径的级联反应中起着必不可少的作用。临床上广泛应用于治疗甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。

随着蛋白质纯化技术的发展，以冷沉淀或Cohn组分I为原料的各种纯化方法不断建立、完善和改良，纯度越来越高FⅧ产品相继产生。低温乙醇法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析等方法都是制备FⅧ制剂的有效方法，特别是几种方法的联合使用，使FⅧ的纯度甚至比原血浆有较大幅度的提高。纯度越来越高的FⅧ制剂在甲型血友病的治疗中发挥着巨大的作用。目前一般接受治疗的血友病人都能够进行正常的生活和工作，生活质量和平均寿命基本接近正常人。

FⅧ在血浆中的含量极微，1ml血浆中仅含0.1～0.2μg，故其纯品的获得受到蛋白纯化技术发展的限制而极为困难。由于国家对原料血浆的严格控制和人凝血因子Ⅷ提取困难，国内只有少数几家公司生产人凝血因子Ⅷ，而我国甲型血友病患者保守估计为7～10万，临床需求巨大，导致人凝血因子Ⅷ临床供应十分紧张，甚至出现“一药难求”的现象。国家食品药品监督管理局批准拜耳医药生产的重组人凝血因子Ⅷ在国内上市，但其高昂的价格(约6元/IU)让国内普通的患者难以承受。而国内生产的人凝血因子Ⅷ价格(约2元/IU)，远低于进口重组人凝血因子Ⅷ，可大大降低患者的医疗成本。本发明为健康人血浆经低温离心分离得到冷沉淀，再经粗分离、离子交换层析提纯、超滤、进行脂包膜病毒灭活(有机溶剂/去污剂法，S/D法)、配制、除菌过滤、分装冻干，冻干后再进行非脂包膜病毒灭活或去除处理(干热法，100℃，30分钟)制成人凝血因子Ⅷ。对缺乏人凝血因子Ⅷ所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。

传统人凝血因子Ⅷ制备方法中有甘氨酸沉淀法、PEG沉淀法、酸沉淀法、离子交换层析法等，制备过程中多采用高速离心法去除杂质不溶物，由于人凝血因子Ⅷ易激活、易水解，特别是剧烈条件易导致活性丧失，蛋白激活从而影响制品的质量。其次，人凝血因子Ⅷ制备过程颗粒物的去除多采用滤芯过滤去除如用1.0μm、0.65.μm、0.45μm等，该种滤芯可去除蛋白颗粒物，但很难去除可溶性的脂质蛋白。再者人凝血因子Ⅷ冷冻干燥过程冻干工艺不成熟易引起蛋白活性损失、质量不合格等。