[发明专利]基于RPA‑IAC技术筛查大豆花叶病毒的方法、RPA‑IAC引物及试剂盒

权利要求书

1.引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的引物对和内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用；

任选的，所述制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒为或候选为大豆花叶病毒的产品。

3.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括RPA-IAC恒温扩增试剂；

任选的，所述RPA-IAC恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits所包含的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括植物总RNA提取试剂；

任选的，所述植物总RNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂；

任选的，还包括反转录试剂；

任选的，所述反转录试剂包括来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit所包含的试剂。

6.权利要求3至5任一项所述的试剂盒在筛查或辅助筛查大豆花叶病毒，或制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品中的应用；

任选的，所述筛查或辅助筛查大豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒，以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒；

任选的，所述制备筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒的产品。

7.一种筛查或辅助筛查大豆花叶病毒的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒，或权利要求3-5中任一项所述试剂盒的步骤；

任选的，所述筛查或辅助筛查大豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染大豆花叶病毒；以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)RPA-IAC扩增

从待测植物样品或待测病毒中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板与权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒，或权利要求3-4中任一项所述试剂盒进行RPA-IAC扩增；

2)根据RPA-IAC扩增的结果判断待测植物样品是否感染大豆花叶病毒，或待测病毒是否为或候选为大豆花叶病毒；

任选的，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：

若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为154bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为338bp、154bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为待测植物样品感染大豆花叶病毒或待测病毒为或候选为大豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为338bp的内标扩增片段，未含有大小为154bp的目标基因片段，则判定为待测植物样品未感染大豆花叶病毒或待测病毒不为或候选不为大豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为338bp的内标扩增片段，同时也未含有大小为154bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行筛查。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

步骤1)中从待测植物样品中提取总RNA是采用天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒进行的；

步骤1)中将总RNA反转录成cDNA是采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit进行的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：

任选的，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。