[发明专利]不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用

权利要求书

1.一种不溶血无乳链球菌WC1535△cyl，其特征在于，所述无乳链球菌WC1535△cyl为不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210，外文名称为Streptococcus agalactiae。

2.如权利要求1所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)先将重组质粒pSET4s-cylCm经过电转化至鱼源无乳链球菌WC1535株感受态细胞，再涂布于含有氯霉素的BHI平板，最后置于28±2℃倒置培养30～40h；

(2)挑取培养所得单克隆菌落至含有氯霉素的BHI液体培养基中，28±2℃培养至对数生长期，然后稀释10000倍后涂布于无抗性的BHI平板上，于37℃倒置培养；PCR检测和测序验证的阳性克隆，即得到所述无乳链球菌WC1535△cyl；

所述重组质粒pSET4s-cylCm由pSET4S质粒和cyl-up-Cm-cyl-down基因片段的无缝克隆得到；

构建所述cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增体系为：

2×PCR Master Mix 25μL、pSET4s-cylF 1μL、pSET4s-cylR 1μL、cyl-up基因片段1μL、cyl-down基因片段1μL、cyl-Cm基因片段2μL，加H₂O至50μL；其中，

pSET4s-cylF:

5′-ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3′

pSET4s-cylR:

5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′；

构建所述cyl-Cm基因片段的扩增体系为：

2×PCR Master Mix 25μL、cyl-CmF 1μL、cyl-CmR 1μL、pSET5S质粒1μL、最后加H₂O至50μL；

所述cyl-CmF和cyl-CmR是根据pSET5S质粒中氯霉素基因序列设计而得，其中，

cyl-CmF:

5′-ATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3′

cyl-CmR:

5′-CTGATTTTCTCATAAAATGTGGCACCGAACTAGAGCTTGATG-3′；

构建所述cyl-up基因片段的扩增体系为：

2×PCR Master Mix 25μL、cyl-upF 1μL、cyl-upR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA 1μL、最后加H₂O至50μL；其中，

cyl-upF:

5′-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGC-3′

cyl-upR:

5′-GAGCCTCGGAACCCATCGAATTACATTGTTCACACCTACTCAAAAT-3′；

构建所述cyl-down基因片段的扩增体系为：

2×PCR Master Mix 25μL、cyl-downF 1μL、cyl-downR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA 1μL、最后加H₂O至50μL；其中，

cyl-downF:

5′-CATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAG-3′

cyl-downR:

5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAACAGTTTCACTTTTGACAAC-3′。