[发明专利]rAAV8-CRISPR-SaCas9系统及在制备乙肝治疗药物中的应用

说明书

本发明公开了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR‑Cas9系统中能够以乙肝病毒基因组特定位点为靶序列进行DNA序列的编辑，本发明还公开了含有该gRNA序列的CRISPR‑SaCas9系统和包装了该系统的重组腺相关病毒。所述系统及包装病毒显示出在细胞内及转基因小鼠机体内强大的HBV清除能力，在连续两次高剂量注射后的第38天，实验组小鼠血清中HBsAg、HBeAg的含量相比对照组分别下降62.96±7.59％和65.18±3.08％；血清中HBV DNA的含量相比对照组下降92.82±3.67％；实验小鼠肝脏及其他脏器均未出现任何病理改变，而且也未检测到脱靶效应，显示出本发明提供的gRNA序列及相应的CRISPR‑SaCas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种gRNA序列及通过CRISPR-Cas9系统对乙肝病毒进行基因编辑的技术，属于基因突变和基因工程技术领域。

背景技术

乙型肝炎(简称：乙肝)是一个严重的全球性公共卫生问题。自1982年以来，乙肝疫苗的应用已经在很大程度上预防了乙肝的传播，但乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原HBsAg阳性持续至少6个月)的人数仍居高不下，到2016年的全球HBsAg阳性人数达到2.4亿。据估计，全球每年有超过68.8万人死于慢性乙肝的并发症，包括肝癌和肝硬化。乙型肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起。HBV基因组是部分双链的闭合环状DNA病毒，通过RNA中间体进行复制。在进入细胞后，HBV DNA包含的核心颗粒就被释放进入细胞核，随后HBV双链被宿主细胞修复成为完整的双链结构并进一步形成共价闭合环状的DNA(cccDNA)。cccDNA在病毒聚合酶的辅助下，不断地在人体内产生病毒蛋白和新的病毒颗粒。目前公认的化学治疗方法包括干扰素-α(Interferon-α，IFN-α)和核苷类似物(Nucleosideanalogue，NAs)。核苷类似物通过抑制多功能逆转录酶来阻断病毒DNA的合成。口服核苷类似物可以有效降低病人体内HBV DNA的水平，但存在停药后病毒暴发的危险，因此病人需要长期服药，然而长期服用核苷类似物又会导致抗药性的产生。相比核苷类似物，干扰素-α具有用药周期短，不会产生抗药性的优点。干扰素-α能通过抑制病毒DNA复制和激活机体抗病毒免疫来达到治疗效果。但是在接受干扰素-α治疗的病人中只有不足10％产生持续的治疗作用。并且干扰素-α的副作用多(比如流感样症状、疲劳和血球计数低等)且具有严格的适应症，因此目前乙肝的治疗仍有诸多困难。

为了能实现持续抑制HBV的复制与表达，科研究人员致力于研究各种新型药物。目前正在研究阶段的新型治疗方法主要包括病毒抑制和宿主细胞抑制两种方式。病毒抑制的方式主要为通过药物靶向抑制病毒生命周期的各个时期，包括HBsAg抑制剂、病毒衣壳抑制剂、核糖核酸酶H抑制剂、DNA裂解酶和siRNA药物。而宿主细胞抑制则主要是利用免疫抑制剂类药物抑制宿主的免疫反应进而减轻病毒引发的炎症。然而要想治愈慢性乙肝，则必须彻底破坏或清除HBV的复制根源—HBV DNA，然而目前尚没有药物能够达到这一目的。近些年发展起来的基因编辑技术，有望成为根治乙型肝炎的最佳途径。从人工合成的锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)到最新的第三代基因编辑技术成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered RegΜLarly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)-Cas9系统，其发展速度快，能够实现对任意DNA序列的精确编辑。利用这些基因编辑工具，研究人员则可以直接靶向HBV DNA，正因如此，基因编辑技术也为从根本上治愈慢性乙肝提供了新的途径。