[发明专利]一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR-Cas9系统的方法

说明书

本发明公开了一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR‑Cas9系统的方法，所述方法包括：(1)将自杀基因、与特异性gRNA结合的靶点序列、以及下游的PAM序列构建到pST_K质粒中；(2)将pST_K质粒转化入染色体整合有温和噬菌体,并且转化有能够表达同源重组相关酶类的质粒的大肠杆菌宿主菌中；(3)将两端携带噬菌体序列同源臂的CRISPR‑Cas9序列重组模板双链DNA线性片段转化入宿主菌中；(4)诱导同源重组相关酶类和自杀基因SacB表达；(5)筛选发生了同源重组的宿主菌；(6)诱导温和噬菌体裂解宿主菌，收获发生重组的包装了CRISPR‑Cas9系统的温和噬菌体。本发明提供的包装方法省略了删除抗性标记的二次重组步骤，高效、快速，为噬菌体载体递呈CRISPR‑Cas9系统对抗耐药菌提供了技术支持。

技术领域

本发明公开了一种噬菌体包装方法。

背景技术

在世界范围内，每年有70万人死于细菌抗生素耐药问题，死亡病例主要来自亚洲和非洲。而在中国，每年就有超过8万人死于耐药菌感染。据英国抗菌药物耐药评估委员会估计，如果目前的情况不能得到改善，到2050年，全球将有1000万人遭遇抗菌素耐药问题，多于目前癌症死亡人数。抗生素滥用不仅严重影响人类健康，也会导致经济损失。最近世界银行和联合国粮农组织的报告指出，如果2050年仍未解决抗生素耐药性问题，全球年度GDP将下降约1.1％-3.8％，等同于2008年金融危机的影响。更为严重的是，细菌耐药基因造成的抗生素失效不仅仅带来临床上感染治疗的困难，细菌耐药性的快速流行和传播使得局面更加难以控制。随着交通工具的进步和不同地区之间交流的增加，细菌耐药基因可以在全球范围扩散。以介导肠道阴性菌耐受碳青酶烯类抗生素的blaNDM基因为例，这种基因在2010年首次从印度治疗的病人身上分离出来，短短几年内变蔓延至全球多个国家和地区。截止2014年，至少66个国家和地区报告检出有NDM家族耐药基因。另外，blaNDM不仅在地区间扩散，生物层面上还能在不同菌种间扩散。到2014年，超过40种细菌中检测出了blaNDM基因，大部分属于肠道菌群，也在致病菌中检出。

耐药基因流行的最主要原因是其往往能定位于细菌的转移性质粒。质粒是细菌细胞里除了染色质以外能够储存遗传信息环状DNA分子，它能够自主进行复制并且在同一生活环境中的菌株和菌种间通过转化、接合等方式进行转移。再以blaNDM-1为例，从不动杆菌检出的blaNDM-1主要定位质粒。而基因周围结构分析结果显示该基因定位在具有转移功能的大片段转座结构Tn125上，使得该基因可以转座至多种细菌质粒，极易在细菌和菌种间易发生水平转移。近年来耐药基因不断向烈性病原菌扩散，导致了超级耐药烈性病原菌的出现。发表在《自然·遗传学》杂志的一项大型国际研究发现，多重耐药的伤寒“超级细菌”已经在全球传播。《柳叶刀·传染病》发表文章表明NDM-1超级耐药基因可以在多种细菌间转移，已发现11种新的含有NDM-1基因的细菌，其中包括常见的烈性病原菌霍乱弧菌、志贺菌和沙门菌。

在耐药危机局面下，新型抗生素的研发远远落后于耐药基因进化的速度，目前主要的策略包括合理使用抗生素、循环用药以及策略性更换抗生素等方法。然而广谱耐药细菌的出现以及抗生素的肝肾副作用等因素使得现有的抗生素种类难以应对目前的局面。亟需新的治疗方案来解决愈演愈烈的细菌耐药问题，并且需要新的技术来阻断耐药基因的水平转移。因而直接针对病原菌携带的耐药基因进行清除以消除细菌耐药性显得至关重要。