[发明专利]一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法

权利要求书

1.一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，所述细胞传感器包括裸金电极以及固定在裸金电极上的巨噬细胞RAW264.7，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)、空白：将细胞传感器一在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后添加PMA丙二醇甲醚醋酸酯，使PMA浓度为100ng/mL，静置10分钟，用PBS缓冲液洗涤2-4次，然后将细胞传感器一连接到电化学工作站；

2)、预处理：将待测物与细胞传感器二在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA，使PMA浓度为100ng/mL，静置10min，然后用PBS缓冲液洗涤2-4次后，将细胞传感器二连接到电化学工作站；

3)、电化学检测：在含有1.0mM Fe(CN)₆^3-或1.0mM Fe(CN)₆^4-或0.1M PBS的溶液中分别对细胞传感器一和细胞传感器二进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I₀和I_S；

4)、判断待测物是否具有抗氧化能力：

4.1)当I₀＞I_S时，说明该待测物具有抗氧化性，进而进入步骤5)评价其抗氧化能力；

4.2)当I₀≤I_S时，说明该待测物没有抗氧化性；

5)评价待测物的抗氧化能力：通过计算相对抗氧化能力值(RAC)来评价待测物的抗氧化能力，相对抗氧化能力值通过以下公式计算：

其中RAC指的是相对抗氧化能力值，I₀是用100ng/mL PMA刺激时的峰值电流，I_S是在待测物保护作用下的峰值电流，I是没有PMA刺激的峰值电流。

2.根据权利要求1所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述细胞传感器的制备方法包括如下步骤：

a)、酸化二氧化锰的制备：将MnO₂在超声波浴中溶解在浓H₂SO₄和浓HNO₃的组合酸液中得到混合液，然后将混合液在冰浴中搅拌3-5h，离心，洗涤和干燥后，得到a-MnO₂纳米材料；

b)、修饰电极的制备：将a-MnO₂纳米材料在超声波下分散在壳聚糖溶液中得到固相浓度为0.9-1.1mg/mL的悬浮液，然后取8-12μL悬浮液滴在干燥的金电极表面上，4-6℃条件下干燥后得修饰电极；

c)、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与浓度为10mmol/L的DMEM培养液按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM高糖培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1％海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10％的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯混合凝胶；

d)、巨噬细胞的培养：在37℃、CO₂含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养巨噬细胞2-3天，得到巨噬细胞悬浮液；

e)、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合，混匀后吸取4-6μL混合了细胞的凝胶滴加在修饰电极的表面，然后浸没于CaCl₂溶液中进行固定，固定3-5min，并置于5％CO₂的37℃培养箱孵育2-4min，制备得到细胞传感器。

3.根据权利要求2所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述细胞传感器的制备方法还包括如下步骤：

清洁：将步骤e)制得的细胞传感器置于Piranha溶液中浸泡12-18min后分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5％的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。