[发明专利]一种孔雀石绿免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学与分析化学技术等，尤其是涉及孔雀石绿免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green，MG)属于人工合成的有机化合物，最初作为工业三苯甲烷类染料被用于纺织业、皮革业和造纸业等行业，也作为生物染色剂，可将细胞或其组织染成蓝绿色，方便在显微镜下研究。但是因1993年起孔雀石绿被证实发现可以作为水产类动物体内外的驱虫剂、防腐剂和杀菌剂，例如水产动物体外的寄生虫，原生动物和鱼卵中的霉菌等。后来被广泛用于治疗与预防各类水产动物的疾病，包括水霉病、鳃霉病、烂鳍病、寄生虫病及其他的一些细菌性疾病。有时也会在运输途中作为消毒剂使用来延长鲜活水产品在长途运输中的存活时间。

孔雀石绿等药物进入人体或动物机体后，可对人体产生致癌、致畸、致突变等危害。孔雀石绿对鱼体毒性影响会受到环境的温度、酸碱度、水的硬度、还有溶氧量等其他多种因素影响，研究表明孔雀石绿对大口妒鱼和蛙鱼的鱼卵鱼苗有着致死的作用。孔雀石绿可在环境中长期存在并对水生生物和陆生生物产生各种毒性。孔雀石绿在水生动物体内通常会迅速代谢成隐性孔雀石绿(LMG)，而隐性孔雀石绿的毒性甚至超过孔雀石绿。因此，为了保障消费者健康必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速的测定方法对孔雀石绿残留进行监控。

目前，常用的检测蛋白同化激素的方法有高效液相色谱法(HPLC)、超高液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、分光光度计法和免疫检测法等。仪器检测方法是目前应用最多的检测方法，具有准确度高、灵敏度好等优点。但该方法的缺点是，需要昂贵的仪器及专业的人员进行操作，样品处理步骤繁锁，需要衍生，回收率低等，所以不适合广泛的推广使用。可视化快速免疫检测技术，像试纸条、凝胶检测柱等，是相对独立的快速检测方法。不需任何仪器设备，分析过程特别是前处理的步骤大大简化了，几分钟就可用肉眼观察实验结果，非常适合于大量样品的现场筛查和基层推广。因此技术具有巨大的发展潜力和应用前景。

发明内容

本发明提出一种可以定性半定量的检测水产品中的孔雀石绿的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱。孔雀石绿免疫亲和凝胶检测柱利用了抗原抗体的特异性结合，以及ZnCdSe/ZnS量子点与待测物孔雀石绿共振能量转移荧光猝灭的原理，依据检测层量子点颜色变化，进而对待测物进行定性半定量分析。本发明首先使孔雀石绿与抗体发生特异性结合，利用ZnCdSe/ZnS量子点的荧光发射光谱与孔雀石绿的吸收光谱能有效重叠，且满足荧光共振能量转移的条件。以ZnCdSe/ZnS量子点为供体，孔雀石绿为受体建立能量共振转移体系，孔雀石绿与ZnCdSe/ZnS量子点共振能量转移荧光猝灭，即首先将垫片装入1ml塑料柱中，然后加入200ul孔雀石绿抗体胶与封闭胶的混合胶(3：1)，用加压注射器将混合胶中PBS液体压出，加入上层垫片，组装好检测柱，然后将不同浓度、一定体积的待测物加入检测柱，用注射器压出检测层中PBS液体，加入50ul制备好的ZnCdSe/ZnS量子点溶液至检测层，根据检测层荧光颜色变化，利用单层检测层可达到检测孔雀石绿的目的。相比于HPLC、LC-MS等方法，本文所建立的方法操作简单；而与无机稀土纳米材料荧光探针法相比，本方法更简便。本发明为孔雀石绿的检测提供了一种新方法，同时拓宽了FRET(荧光能量共振转移)在食品检测方面的应用。

为实现上述技术效果，本发明采用的技术方案是：

一种孔雀石绿免疫亲和凝胶检测柱，所述检测柱包括一层检测层，所述检测层是首先孔雀石绿抗体胶与封闭胶按体积比3:1混合加入检测柱，然后加入ZnCdSe/ZnS量子点形成的。

进一步，所述封闭胶的制备：使用溴化氰活化琼脂糖凝胶，之后加入HCl溶液，搅拌溶胀后转移到具砂板层析柱中，用1mM/L PH＝3.0的HCl溶液进行淋洗，再用偶联缓冲液(NaHCO3:4.2g，NaCL:14.6g，双蒸水定容至500mL，用NaOH调节PH至8.3)冲洗柱子，调解柱子至中性，加入甘氨酸封闭液(甘氨酸0.6g，溶于20ml偶联缓冲液中)室温反应2h，再用偶联缓冲液和醋酸钠缓冲液(CH₃COOH:0.58ml，NaCl：2.92g，双蒸水定容至100ml，用无水乙酸钠调节PH至4.0)反复冲洗，待清洗液抽空，将制备好的封闭胶用含有0.3ml/L抑菌素的PBS悬起，封闭胶与PBS体积比1:3，放置于4℃保存待用；