[发明专利]一种重组肿瘤抗原其制备方法和编码核酸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及含有抗原的医药制品领域，具体地，是一种重组肿瘤抗原其制备方法和编码核酸及其用途。

背景技术

癌症的传统治疗手段如：手术治疗、放射治疗和化疗等，均具有一定的局限性。手术治疗只适合早期肿瘤；而放疗和化疗由于靶向性较差，易损伤正常细胞，产生不良反应。恶性肿瘤具有易侵袭和易复发的生物学特征，因此需要靶向性更好、毒性更小的治疗方案。随着肿瘤学的发展，生物免疫疗法成为肿瘤治疗的第四种手段。有研究证明，肿瘤细胞具有特异性的肿瘤抗原，免疫系统能通过识别肿瘤抗原区别肿瘤细胞和正常细胞。在肿瘤患者中，免疫系统受到抑制，无法正常识别肿瘤细胞表面的肿瘤抗原，进而有效杀伤肿瘤细胞。树突细胞肿瘤疫苗通过特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原(如：多肽、RNA等)负载树突细胞，在各种细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下，激活或加强机体自身抗肿瘤免疫，进而杀伤和清除肿瘤细胞。目前，树突细胞肿瘤疫苗已成为肿瘤治疗领域的研究热点。

AKR1B10又叫做醛糖还原酶相似蛋白-1，小肠还原酶或醛糖还原酶相关蛋白，其基因位于ch7q33，转录的产物长为1376bp，含有10个外显子，AKR1B10蛋白一共有316个氨基酸，其分子量为36.02kDa。AKR1B10基因在人的大多数组织里面不表达，它主要在小肠，结肠和胃里面表达，在肝脏，胸腺，前列腺和睾丸中也有低水平存在。但是在人的肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等几种癌症中高表达，可以通过解毒细胞内的活性羰基促进肿瘤细胞生长。鉴于此，AKR1B10基因可以做为肿瘤免疫治疗的一个靶点，以之作为肿瘤抗原刺激机体，能够产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可引起有效的抗肿瘤免疫反应。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种含有AKR1B10基因的肿瘤抗原、编码核酸及其制备方法，以及将该抗原用于负载树突细胞，用于主动免疫治疗高表达AKR1B10基因的癌症，包括但不限于肝癌，非小细胞肺癌，乳腺癌等。

本发明是按照以下技术方案实现的：

一种重组含有AKR1B10编码区的肿瘤抗原，所述的重组抗原包含有：人GP96基因的信号肽序列编码区，人AKR1B10基因的编码区，人LAMP1基因信号序列编码区，以及A64的ployA结构区域。

所述的重组抗原的制备方法，其包括以下步骤：

1)根据Genebank报道的人AKR1B10基因、人gp96基因、人LAMP1基因的编码序列，根据以下规则，进行密码子优化：1.选用高GC含量的密码子，使优化后的核酸序列GC含量在50％～75％；2.去掉稀有密码子，选用在人源细胞中使用频率高的密码子；3.优化去掉可能形成二级结构的核酸序列；4.优化去掉消极的顺式作用原件。

2)构建融合表达AKR1B10抗原以及促进抗原呈递的信号肽的重组质粒，含有AKR1B10基因的核酸序列如核酸序列表所示：

3)将合成的重组载体以限制性内切酶线性化后，采用T7体外转录酶体外转录合成包含重组AKR1B10基因序列的信使RNA。

附图说明

图1是本发明流式细胞仪检测DC细胞转染效率图

图2是本发明流式细胞仪检测DC细胞表型图

图3是本发明荧光定量PCR法检测AKR1B10抗原在转染后DC细胞负载情况图

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例一：重组抗原基因的合成以及制备

1.根据前文所述规则，对人AKR1B10基因，gp96基因和LAMP1基因进行密码子优化，合成优化后的基因，克隆合成后的重组基因到载体psp73上。

2.将合成的载体psp73-AKR1B10转化大肠杆菌感受态细胞stb13中，过夜培养扩增后，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。

3.将提取的重组质粒按照如下体系进行酶切(以100ul体系为例)：10x cutsmart buffer，10ul；重组质粒DNA(1000ng/ul)，50ul；超纯水，35ul；SpeI-HF限制性内切酶，5ul。充分混匀后于37℃反应2小时。

4.酶切产物中加入70ul异丙醇，充分混匀后放于-20℃沉淀30分钟。

5.以14000RPM，4℃离心10分钟，沉淀DNA。去上清，以1ml 75％乙醇洗沉淀两次。

6.加入30ul超纯水溶解沉淀，以核酸定量仪检测DNA浓度，用超纯水将浓度稀释到1000ng/ul，得到speI酶线性化的重组质粒。