[发明专利]血清外泌体中肺癌相关microRNA分子标记的应用及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了外泌体相关microRNA在制备诊断和预示肺癌标志物中的应用及试剂盒，开发出基于PCR平台miRNA的两步法检测试剂盒，通过上调分子标志物和下调分子标志物联合使用，在肺癌的辅助诊断方面具有突出优势，灵敏度最低可达到1copy/μL，极大提高了检测的准确度。另外，本发明开发出等温扩增技术miRNA的一步法检测体系更快速、便捷，可大大提高检测效率，降低检测成本。

技术领域

本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及肺癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒。

背景技术

外泌体(exosome)是一种广泛存在并分布于各种体液中可由多种细胞分泌的膜性小囊泡，直径一般介于30～120nm之间，包含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，除了能作携带和传递重要的信号分子，形成一种全新的细胞间信息传递系统从而改变其他细胞的功能外，在很多生理病理上起着重要的作用。研究表明，肿瘤exosome的分子特征部分反映其来源肿瘤的表型，所携带的肿瘤特异性microRNA和抗原可以作为肿瘤诊断标志物。此外exosome可以选择性的将某些细胞蛋白移出，在细胞之间传递很多种类型的分子，可以诱发与增强机体免疫反应，在免疫监视、炎症反应及癌症发生发展等许多生理和病理过程中有重要的功能。在包括膀胱癌、脑瘤、结直肠癌和黑色素瘤在内的多种肿瘤临床病例中，均能从患者血清或尿液等体液中分离exosome用于早期临床诊断，也可用于肿瘤的临床风险或疗效评估，以及预后判定。

外泌体中含有大量mRNA和microRNA，不仅保护体外RNA稳定存在免遭降解，还能够作为有效的载体将RNA转运到特定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。Exosome承载的120多种microRNA具有多种功能。如miR-1、miR-17、miR-18、miR-181和miR-375与血管生成、造血、细胞外分泌和肿瘤的发生有关。

microRNA(又称miRNA或miR)——作为Science 2002年十大科技突破的第一名——是21世纪生命科学研究重大发现之一，它在生物的发育时序调控和疾病的发生中起到非常重要的作用。miRNA通过调节癌基因及抑癌基因的表达，调控细胞的分化、增殖、凋亡，从而促进或抑制肿瘤的发生，期间有着复杂的调节机制，形成调控网络，共同促进或抑制肿瘤的发生。甲基化、生物起源上的缺陷、变异、转录的异常以及基因组的丢失或扩增等均导致miRNA在人类肿瘤中的异常，许多miRNA直接表现为一种原癌基因或抑癌基因的作用，致癌与抑癌miRNA通过正向或负向调控肿瘤抑制基因、癌基因或控制细胞周期进程、分化或凋亡的基因，直接调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，参与肿瘤的生成、发展甚至侵袭转移。大量的研究显示，miRNA在肿瘤细胞、癌组织、癌旁组织、正常组织中都有特征性的表达谱改变，在肿瘤患者的血尿中也有特征性的表达水平改变，这就为肿瘤的诊断提供了新的思路，也提示miRNA可能可以成为肿瘤诊断的重要的分子生物学标志。

外周血因其具有创伤小、易获取、可重复、可检测指标众多等优点，一直是临床疾病标志物检测的主要标本来源。近年研究发现，外周血中存在内源性循环miRNA，且因其具有较高的稳定性和特异性，有望成为诸如肿瘤等多种疾病的生物学标志物。有研究者提出，循环miRNA主要存在于外泌体中，有可能成为较好的检测血清miRNA的来源。因此，若结合exo-miRNA的相关特点，如果能研发出相应的高特异性肺癌诊断试剂盒使之能够应用于肺部结节良恶性辅助的鉴别诊断及科研领域，将很好地促进肺癌筛查研究及科研成果的转化，对于良恶性肺部肿瘤的区分、诊疗必将起到巨大的推动作用。

目前，已有的microRNA做为检测肺癌分子标志物的应用，因其准确性、特异性不高或需要几个标志物同时检测，检测成本高等缺陷，并没有适合商业化生产的试剂盒。