[发明专利]一种基于3D打印的仿生软骨及其制造方法

权利要求书

1.一种基于3D打印的仿生软骨，其特征在于，由改性Ⅱ型胶原蛋白、改性透明质酸、纳米羟基磷灰石和软骨细胞通过梯度仿生3D打印制得；按重量份数计由改性Ⅱ型胶原蛋白20-80份、改性透明质酸20-80份、纳米羟基磷灰石10-20份和软骨细胞0.1-0.5份组成；所述仿生软骨由下至上依次由仿生软骨下骨、仿生钙化层、仿生软骨深层、仿生中间层和仿生浅表层通过3D打印机打印构建所得，整体呈多层的互穿网络结构；其制造方法具体步骤如下：

（1）打印材料的制备：

①所述改性Ⅱ型胶原蛋白的制备：将Ⅱ型胶原蛋白加入到50℃的PBS磷酸盐中配制成质量浓度为10%的Ⅱ型胶原蛋白PBS磷酸盐溶液，然后按体积比VⅡ型胶原蛋白PBS磷酸盐溶液：V甲基丙烯酸酐=10:0.75加入甲基丙烯酸酐，在50℃下搅拌反应4小时，反应结束后，将所得溶液置于截留分子量为10000的透析袋中透析7天，然后将得到的透析液置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得改性Ⅱ型胶原蛋白，置于室温下存储，备用；

②改性透明质酸的制备：将透明质酸溶解于蒸馏水中配制成质量浓度为2%的透明质酸溶液，然后加入摩尔浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH至8.5得到透明质酸钠溶液，然后按质量比m透明质酸钠：m甲基丙烯酸二甲氨基乙酯= 1:3.5加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，在10℃下反应24h后，将所得溶液置于截留分子量为14000的透析袋中流水透析7天，然后将透析液置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得改性透明质酸，置于室温下存储，备用；

③将软骨细胞消化后，加入到含有体积分数为10%的牛血清的软骨细胞培养基中，配制成细胞浓度为1×10⁶—5×10⁶mL^-1的软骨细胞悬浮液，置于二氧化碳浓度为5%、温度为37℃的细胞培养箱中备用；所述软骨细胞为正常培养3代后的软骨细胞；

（2）各仿生层前驱体的制备：

①仿生软骨下骨前驱体的制备：往蒸馏水中依次加入光引发剂Irgacure2959、步骤（1）制备所得的改性Ⅱ型胶原蛋白，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，然后加入纳米羟基磷灰石，搅拌至纳米羟基磷灰石均匀分散在溶液中，得到仿生软骨下骨前驱体溶液，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%、纳米羟基磷灰石的浓度为5-10wt%，改性Ⅱ型胶原蛋白的浓度为5-10 wt%；

②仿生钙化层前驱体的制备：往蒸馏水中依次加入光引发剂Irgacure2959、步骤（1）制备的改性透明质酸，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，然后加入纳米羟基磷灰石，搅拌至纳米羟基磷灰石均匀分散在溶液中，得到仿生钙化层前驱体溶液，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%、纳米羟基磷灰石的浓度为1-5wt%，改性透明质酸的浓度为1-3 wt %；

③仿生软骨深层前驱体的制备：往蒸馏水中依次加入光引发剂Irgacure2959、步骤（1）制备的改性透明质酸、步骤（1）制备的改性Ⅱ型胶原蛋白，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，然后加入等体积的步骤（1）所配制的软骨细胞悬浮液，轻柔搅拌至混合均匀，得到仿生软骨深层前驱体溶液，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%、改性透明质酸的浓度为1-3 wt %，改性Ⅱ型胶原蛋白的浓度为10-15wt%，软骨细胞的浓度为5×10⁵—2.5×10⁶mL^-1；

④仿生中间层前驱体的制备：往蒸馏水中依次加入光引发剂Irgacure2959、步骤（1）制备的改性透明质酸、步骤（1）制备的改性Ⅱ型胶原蛋白，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，得到仿生中间层前驱体溶液，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%、改性透明质酸的浓度为2-5 wt %，改性Ⅱ型胶原蛋白的浓度为10-15wt%；

⑤仿生浅表层前驱体的制备：往蒸馏水中依次加入光引发剂Irgacure2959、步骤（1）制备的改性Ⅱ型胶原蛋白，每次加入的物质完全溶解后再加入下一种物质，得到仿生浅表层前驱体溶液，备用；其中，光引发剂Irgacure2959的浓度为0.5wt%、改性Ⅱ型胶原蛋白的浓度为10-15wt%；

（3）仿生软骨的仿生打印：

将步骤（2）制备所得的各仿生层前驱体按仿生软骨下骨前驱体、仿生钙化层前驱体、仿生软骨深层前驱体、仿生中间层前驱体、仿生浅表层前驱体的顺序依次叠加打印，即得一种基于3D打印的仿生软骨；其中所述仿生软骨下骨的打印厚度设置为仿生软骨总厚度的5~10%、所述仿生钙化层的打印厚度设置为仿生软骨总厚度的2~5%、所述仿生软骨深层的打印厚度设置为仿生软骨总厚度的15~30%、所述仿生中间层的打印厚度设置为仿生软骨总厚度的40~55%、所述仿生浅表层的打印厚度设置为仿生软骨总厚度的10~20%。