[发明专利]一种产生三基因片段DNA融合方法及应用有效
| 申请号： | 201710695660.X | 申请日： | 2017-08-14 |
| 公开（公告）号： | CN107384950B | 公开（公告）日： | 2020-03-20 |
| 发明（设计）人： | 罗鹏;赵喜珍;何香燕;卢泽禹 | 申请（专利权）人： | 广州诺晶生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/10 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 宋静娜;郝传鑫 |
| 地址： | 510000 广东省广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 产生 基因 片段 dna 融合 方法 应用 | ||
1.一种产生三片段DNA融合方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)通过PCR扩增获得包含A基因片段和C基因片段的基因片段，将扩增获得的基因片段与载体质粒连接，获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；
(2)以步骤(1)中获得的质粒为模板，进行反向PCR扩增，获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的DNA片段；
(3)以含D基因片段的DNA为模板，通过PCR扩增获得A’DC’基因片段，其中A’基因片段与A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；
(4)将步骤(2)中扩增得到的DNA片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组，获得重组产物；
(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；
(6)以步骤(5)中含ADC基因片段的质粒为模板，通过PCR扩增获得ADC基因片段。
2.根据权利要求1所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，步骤(1)中所述获得包含A基因片段和C基因片段的质粒的方法为：当如附图1中所示的ABC基因片段为天然存在的一段DNA片段时，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；当A基因片段和C基因片段不是天然存在于一段基因序列时，通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒。
3.根据权利要求2所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，所述载体质粒为pMD19-T，所述步骤(1)及步骤(5)中的宿主细胞均为大肠杆菌DH5α。
4.根据权利要求2所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，所述载体质粒与ABC基因片段或AC基因片段的摩尔比为1：(2～4)。
5.根据权利要求1所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的上游引物5’端序列与步骤(1)中A基因片段3’端有18～20bp的碱基序列相同，下游引物的5’端序列与步骤(1)中C基因片段5’端有18～20bp的碱基序列反向互补。
6.根据权利要求1～5任一项所述的产生三片段DNA融合方法在不同基因片段的融合、启动子和融合基因构建、带长同源臂的靶基因构建中的应用。
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