[发明专利]应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异miRNAs表达谱的方法

权利要求书

1.一种应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异miRNAs表达谱的方法，其特征在于：包括如下操作步骤：

(1)培养牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞：选取新鲜拔除的第三磨牙，在无菌条件下取出牙髓、根尖牙乳头组织，将组织剪碎，并采用I型胶原酶及dispase酶于37℃下消化30min，之后离心重悬，用细胞筛过滤重悬液，获得单细胞悬液；

(2)牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的分选：对步骤(1)中获得的单细胞悬液，利用胰酶消化收集其中对数生长期的细胞，并依据抗体说明书采用鼠抗人STRO-1-PE标记细胞，经免疫磁珠分选收集STRO-1阳性细胞，所收集到的STRO-1阳性细胞即为所需的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞；

(3)二代测序技术检测细胞miRNAs表达谱：分别取步骤(2)经分选后的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞，加入Trizol混合后抽提总RNA；使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit，按照厂家的标准流程，主要步骤如下：测定RNA的浓度、琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性、以及测定RNA的RIN值，完成RNA样本质检后，使用接头对切胶回收的20-40nt的miRNAs的3’与5’端进行连接，逆转录合成cDNA第一链，随后进行PCR扩增，PCR扩增产物经PAGE电泳质检、切胶纯化、浓度测定以及质检后，将浓度统一调整为2nM，miRNAs文库构建即告完成；待测miRNAs文库在cBot上完成簇类生长，然后将流通池转移到基因测序系统上，按照标准流程进行二代测序及数据分析。