[发明专利]一种魟鱼软骨多糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种魟鱼软骨多糖的制备方法。

背景技术

魟鱼属脊椎动物门软骨鱼纲板腮亚纲鳐目魟鱼科，在我国黄海、渤海、东海、南海都有分布，当今所用者，主要为赤魟，也有其他数种。随着医药科技的发展， 人们对软骨抗肿瘤的研究愈来愈深入，在诸多软骨的研究中，以鲨鱼软骨的研究令人瞩目，然而，由于鲨鱼性成熟期晚、性周期长, 再加上无节制的捕杀,造成软骨资源匮乏。我国沿海海域广阔, 其魟鱼资源丰富而价格低廉, 将是理想的软骨资源。目前，我国在魟鱼生理活性物质的研究方面取得了一定进展，从魟鱼软骨中提取、分离出具有抗肿瘤活性成分，其他部位含有的活性成分也有研究。

据报道，魟鱼软骨中含有血管生成抑制因子，黏多糖可通过抑制新生血管形成来抑制肿瘤组织的生长和转移，可破坏肿瘤细胞的生长。S180肿瘤体外活性研究结果提示魟鱼软骨多糖可能具有较高的抗肿瘤活性，并具有促进机体免疫功能的作用，但对魟鱼软骨多糖免疫调节活性的研究少有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种魟鱼软骨多糖的制备方法，利用活性多肽和反复冻融法及梯度超声波辅助冻融对软骨细胞壁破碎，提高多糖得率，并且通过分离纯化进一步提高多糖纯度，提取的多糖分子量低，免疫力调节效果好，人体易吸收。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种魟鱼软骨多糖的制备方法，包括预处理；细胞破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥，具体操作步骤如下：

1）预处理步骤为：取新鲜魟鱼软骨，干燥处理，粉碎，过50-70目筛网，石油醚除脂，得脱脂魟鱼软骨粉末；

2）细胞破碎：取魟鱼软骨粉末过筛，制成溶液固液比1:60~80并加入软骨重量0.4%~0.6%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为HSHACASYYCSKFAACGTASCTHYPGKLCACVNCSR，选用磷酸钠盐缓冲液pH=6.7~7.0作为提取剂，在-20℃和37℃，反复冻融3-4次，每次3-4h，梯度超声波辅助冻融，超声波功率为500-700w，时间为15-20min，每隔10~20min超声波功率增强10~20w，直至反复冻融结束，4500-6000r/min条件下离心5-10min，得粗蛋白提取液；

3）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，加入的乙醇为藻液体积的3-4倍，乙醇浓度为92%-95%，乙醇醇沉时间为4-6h，4500-6000r/min离心10-15min，得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为3500-5000Da，自来水流水透析40-44h，蒸馏水透析15-20h，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥，得软骨粗多糖；

4）多糖柱层析：将软骨多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱3.5×25cm，蒸馏水洗脱用0~2.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0Ml/min，收集洗脱液，将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，NaCl洗脱，0.1mol/L的NaCl洗脱，流速0.2mL/min，收集洗脱液真空浓缩，流水透析40-42h，蒸馏水透析40-45h；

5）将透析液于-40℃至-38℃条件下冷冻干燥，得软骨多糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明利用活性多肽和反复冻融的方法使细胞壁破裂较为彻底，促进胞内物质溶出，不破坏其中有效成分；

2）使用的活性多肽具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于水中，亲脂性使其与软骨细胞膜结合，使细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，有利于软骨多糖得率，利用活性肽结合冻融法进行细胞破碎，大大缩短了提取时间，提取效果好，得到的粗多糖含量高，还有效避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性；

3）在反复冻融过程中梯度提升超声波功率，逐步提高细胞壁的破碎，逐步破坏细胞壁，使细胞内容物缓慢释放，显著提升了软骨多糖的得率；

4）提取得到的软骨多糖得率高，纯度高而且多糖分子量低，人体易吸收，提取所需设备少，提取成本低；

5）提取的软骨多糖在具有免疫力调节功能的保健品、饮品中应用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种魟鱼软骨多糖的制备方法，包括预处理；细胞破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥，具体操作步骤如下：

1）预处理步骤为：取新鲜魟鱼软骨，干燥处理，粉碎，过64目筛网，石油醚除脂，得脱脂魟鱼软骨粉末；